β—萘黃酮誘導劍尾魚肝臟cDNA文庫的構建及分析.pdf

1、當今，水生實驗動物開發(fā)和研究備受世界各國的重視，預示著水生實驗動物科學又進入了一個新的發(fā)展階段。我國標準水生實驗動物的開發(fā)研究起步較國外晚，經過近十多年的努力，在劍尾魚、稀有鮈鯽和紅鯽的實驗動物化研究方面取得了可喜的成績。 劍尾魚原產地為墨西哥及危地馬拉，1987年，中國水產科學研究院珠江水產研究所開始了劍尾魚的定向培養(yǎng)和相關的實驗動物化研究工作。到目前為止，劍尾魚已經被應用到水環(huán)境監(jiān)測、水產藥物安全評價、動物疾病模型等方面。由

2、于近交劍尾魚的遺傳均一性較高，加上飼養(yǎng)過程的營養(yǎng)標準化和管理規(guī)范化，作為一種標準化的實驗材料，保障了不同個體在應用中的反應一致性和實驗的可重復性，從而提高研究的總體水平。但是劍尾魚的已知EST序列還相對較少，許多功能基因以及可以在水環(huán)境監(jiān)測中應用的基因數(shù)量更是有限，限制了劍尾魚的應用。 本研究以暴露于β—萘黃酮(beta-Naphthoflavone，β-NF)中的劍尾魚(Xiphophorushelleri)為研究對象，采用S

3、MARTTM(Switching Mechanism At5’end of RNA Transcript)技術，成功構建了劍尾魚肝臟cDNA文庫。用SV Total RNA Isolation System試劑盒提取mRNA后，以逆轉錄酶MMLV Reverse Transcriptase反轉錄合成第一鏈cDNA，然后通過LD-PCR合成并擴增ds cDNA。擴增產物經純化、酶切、過CHROMASPIN-400TM柱去除小片段后，連接到

4、SfiI消化過的pDNR-LIB質粒栽體中，最后用電轉化法將重組質粒轉化到E.coli DH5α內得到原始文庫，擴增后的文庫保存在96孔細胞培養(yǎng)板中。經測定該文庫約含有4.2×107個重組子，重組效率達99％，插入片段多在0.6～2.5 kb之間，平均插入片段長度約1.3kb，擴增后文庫滴度為7.0×109CFU/mL。隨機挑取1000個重組子進行測序檢驗，共得到長度大于500bp的Expression sequence tag(EST