澳洲茄邊堿通過PGE2-EP4及其下游DNMT1-c-Jun調控肺癌細胞生長機制.pdf

1、目的:
　　澳洲茄邊堿屬于扶正抗癌方中龍葵的生物堿成分，文獻報道扶正抗癌方治療肺癌有良好的效果，隨著相關研究的深入，對扶正抗癌方內的單味中藥所含的單體成份的研究也逐漸開展?，F有研究報道，龍葵以及澳洲茄邊堿對于多種腫瘤均有較明顯的抑制作用，但相關的作用機理報道較少。通過前期實驗研究，我們發(fā)現澳洲茄邊堿對肺癌細胞生長有良好的抑制作用。我們設置此課題，通過體內和體外實驗進一步闡明澳洲茄邊堿抑制非小細胞肺癌細胞生長可能的分子機制。

2、　　方法:
　　采用四甲基偶氮甲唑鹽比色(MTT)方法檢測澳洲茄邊堿對肺癌細胞(A549、H1299、H1299、H1650、H1975)的生長的抑制作用，比較不同濃度澳洲茄邊堿對肺癌A549、H1299細胞在24h，48h和72h的細胞活力的影響。采用流式細胞術(FlowCytometry，FCM)檢測澳洲茄邊堿作用48h后對A549和H1299肺癌細胞周期的影響。
　　利用蛋白質免疫印跡法(Western Blot，WB

3、)檢測澳洲茄邊堿(6.0μ M)不同時間點對A549和H1299肺癌細胞Akt、ERK等激酶蛋白磷酸化的表達的影響。利用蛋白質免疫印跡法檢測不同濃度梯度澳洲茄邊堿作用于A549和H1299肺癌細胞24小時后SP1、EP4、NF-κ B、DNMT1、c-Jun等蛋白表達情況。通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測澳洲茄邊堿(6.0μ M)對A549和H1299肺癌細胞EP4 mRNA表達水平的影響;采用雙熒光素酶報告基因法檢測澳洲

4、茄邊堿對A549和H1299肺癌細胞EP4啟動子活性的影響;采用ERK抑制劑(PD98059)，觀察澳洲茄邊堿通過p-ERK對DNMT1蛋白表達的影響。采用外源性過表達（質粒轉染）技術研究澳洲茄邊堿作用后，觀察相關蛋白表達的相互影響。
　　動物實驗采用A549-Luc細胞接種裸鼠腋下形成移植瘤模型。采用隨機數字法分組，分為:空白對照組、澳洲茄邊堿低劑量組(4mg/kg)、澳洲茄邊堿高劑量組(8mg/kg)。隔天一次腹腔注射給藥，用

5、藥30天。采用小動物活體成像技術觀察比較，澳洲茄邊堿低劑量和高劑量處理后裸鼠瘤體生物熒光信號與對照組的差異。觀察比較處理前后瘤體體積、瘤體重量與對照組的變化。提取瘤體組織蛋白，采用Western Blot法觀察高劑量澳洲茄邊堿處理后裸鼠瘤體組織相關蛋白EP4、DNMT1、c-Jun、p-ERK與對照組比較蛋白表達的變化。
　　結果:
　　本研究分別從體外實驗和體內實驗證實了澳洲茄邊堿對肺腺癌細胞生長的抑制作用，及其可能的分子

6、機制。
　　細胞實驗結果顯示，四甲基偶氮甲唑鹽比色(MTT)方法證實澳洲茄邊堿對多株肺癌細胞的生長具有抑制作用，同時證實澳洲茄邊堿對肺癌A549和H1299細胞的生長抑制隨著用藥劑量的增加和作用時間的延長作用越明顯，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。流式細胞術檢測證實澳洲茄邊堿對肺腺癌A549、H1299細胞的細胞周期可阻滯在G0/G1期，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　結果顯示，澳洲茄邊堿對Akt的磷酸化具有抑制作

7、用，對SP1、NF-κ B(p65)、EP4蛋白的表達具有抑制作用，其隨著劑量的增加和作用時間的延長作用越明顯，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　外源性過表達Akt可以阻滯澳洲茄邊堿對SP1蛋白表達的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);外源性過表達SP1對澳洲茄邊堿阻滯p-Akt蛋白表達無明顯作用，差異不具有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。外源性過表達SP1可以阻滯澳洲茄邊堿對p65蛋白表達的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(

8、p＜0.05);外源性過表達p65對澳洲茄邊堿阻滯SP1蛋白表達無明顯作用，差異不具有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。外源性過表達p65可以阻滯澳洲茄邊堿對EP4蛋白表達的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。外源性過表達EP4對澳洲茄邊堿阻滯SP1、p65蛋白表達無明顯作用，差異不具有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。過表達EP4對澳洲茄邊堿阻滯p-Akt蛋白的表達具有陽性負反饋作用。同時，熒光定量PCR(qRT-PCR)法和雙熒光素酶報

9、告基因法證明澳洲茄邊堿(6.0μM)可以降低A549和H1299肺癌細胞EP4 mRNA水平以及降低EP4啟動子活性。
　　結果顯示，澳洲茄邊堿對ERK的磷酸化具有促進作用，對DNMT1、c-Jun蛋白的表達具有抑制作用，其隨著劑量的增加和作用時間的延長作用越明顯，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　外源性過表達EP4可以阻滯澳洲茄邊堿對c-Jun蛋白表達的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);外源性過表達c-Ju

10、n對澳洲茄邊堿阻滯EP4蛋白表達無明顯作用，差異不具有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。外源性過表達EP4可以阻滯澳洲茄邊堿對p-ERK蛋白表達的促進作用，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。ERK抑制劑PD98059可以阻滯澳洲茄邊堿對DNMT1蛋白表達的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。外源性過表達DNMT1可以阻滯澳洲茄邊堿對c-Jun蛋白表達的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。外源性過表達c-Jun對澳洲茄邊堿阻滯D

11、NMT1蛋白表達無明顯作用，差異不具有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。過表達c-Jun對澳洲茄邊堿促進p-ERK蛋白的表達具有陽性負反饋作用。
　　在動物實驗中，澳洲茄邊堿對移植瘤瘤體的體積增長具有明顯的抑制作用。澳洲茄邊堿低劑量組(4mg/kg)與高劑量組(8mg/kg)瘤體與對照組比較，移植瘤瘤體的生物熒光信號值都有明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。瘤體的重量偏輕，體積偏小，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。同時，統(tǒng)計

12、第15、20、30天，澳洲茄邊堿高劑量組與低劑量組瘤體體積較對照明顯偏小，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。在第20、30天，澳洲茄邊堿高劑量組與澳洲茄邊堿低劑量組比較，高劑量組瘤體體積有明顯偏小，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。說明澳洲茄邊堿對移植瘤瘤體的體積增長有抑制作用，且隨著用藥時間的延長與對照組的差異越明顯。采用WesternBlot技術檢測瘤體組織相關蛋白的表達顯示體內實驗結果與體外實驗相關蛋白表達的變化趨勢一致:與空

13、白對照組相比，澳洲茄邊堿高劑量組ERK的磷酸化水平升高，與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。澳洲茄邊堿高劑量組可以降低EP4、c-Jun和DNMT1蛋白的表達水平，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　結論:
　　本研究分別從體外實驗和體內實驗證實了澳洲茄邊堿對肺腺癌細胞生長的抑制作用。體外實驗結果證明，澳洲茄邊堿對肺腺癌A549、H1299細胞的細胞活力具有抑制作用，且成劑量以及時間依賴關系，隨著澳洲

14、茄邊堿劑量的增大以及給藥時間的延長，澳洲茄邊堿對肺腺癌A549、H1299細胞的細胞活力的抑制作用越明顯。證明澳洲茄邊堿對肺腺癌A549、H1299細胞的細胞周期的影響，對兩株細胞的細胞周期均可阻滯在G0/G1期。證實澳洲茄邊堿可能通過PI3k/Akt通路，抑制核轉錄因子SP1以及NF-κ B(p65)蛋白的表達，在轉錄與翻譯水平抑制EP4的表達。通過對EP4蛋白表達的抑制，阻滯肺腺癌A549、H1299細胞增殖。實驗結果提示EP4在澳

15、洲茄邊堿調節(jié)肺腺癌細胞增殖過程中起著重要作用。我們進一步對EP4的下游通路作深入研究，發(fā)現EP4可以通過對p-ERK的調節(jié)，進而影響DNMT1以及c-Jun的表達，同時證明c-Jun蛋白在澳洲茄邊堿抑制肺腺癌A549、H1299細胞增殖中的重要作用。
　　在動物實驗中，澳洲茄邊堿對移植瘤瘤體的體積增長具有明顯的抑制作用。與對照組比較，澳洲茄邊堿低劑量組與高劑量組瘤體的重量偏輕，體積偏小。同時，本次試驗中澳洲茄邊堿高劑量組與低劑量組

16、比較，高劑量組抑制作用更明顯。澳洲茄邊堿對移植瘤瘤體的增殖隨著用藥時間的延長，與對照組差別越明顯。
　　在體外實驗和體內實驗中，澳洲茄邊堿對肺腺癌細胞生長具有明顯的抑制作用。本研究提示，EP4蛋白及其下游c-Jun蛋白在澳洲茄邊堿抑制肺癌細胞生長的過程中起到重要作用，EP4蛋白及其下游c-Jun蛋白的表達的變化對肺癌細胞生長具有調節(jié)作用。
　　綜上所述，本研究體內實驗與體外實驗相關蛋白表達的變化結果一致，進一步肯定了澳洲茄邊