SHH信號(hào)通路在順鉑損傷后斑馬魚(yú)幼魚(yú)側(cè)線(xiàn)毛細(xì)胞再生過(guò)程中的表達(dá)及意義.pdf

1、背景:耳毒性是順鉑臨床應(yīng)用中的一個(gè)嚴(yán)重毒副作用，目前缺乏有效藥物用于順鉑耳毒性的預(yù)防及治療。既往研究認(rèn)為成年哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)耳蝸毛細(xì)胞缺乏自發(fā)再生能力，近年來(lái)通過(guò)外源性基因的誘導(dǎo)、促分化作用使成年鼠類(lèi)內(nèi)耳毛細(xì)胞再生成為可能，這也為人類(lèi)內(nèi)耳毛細(xì)胞再生帶來(lái)了希望。因此，促進(jìn)損傷后毛細(xì)胞再生也許能成為解決順鉑耳毒性這一難題的另一途徑。毛細(xì)胞再生是一個(gè)多因子參與調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，Math1基因、Notch信號(hào)通路、bFGF等都被證實(shí)能調(diào)控毛細(xì)胞的

2、再生。Sonic hedgehog(Shh)信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物耳蝸發(fā)育及毛細(xì)胞形成中，起著非常重要的調(diào)控作用，盡管目前有大量關(guān)于Shh在內(nèi)耳發(fā)育過(guò)程中作用的研究，但是其在毛細(xì)胞再生過(guò)程中的作用卻不十分清楚。斑馬魚(yú)是新興脊椎類(lèi)模式生物，其基因與人類(lèi)基因相似度約87％，斑馬魚(yú)幼魚(yú)側(cè)線(xiàn)毛細(xì)胞已經(jīng)是一個(gè)比較成熟的毛細(xì)胞再生研究模型，側(cè)線(xiàn)毛細(xì)胞與斑馬魚(yú)內(nèi)耳毛細(xì)胞在發(fā)育和分化立體模式、結(jié)構(gòu)及功能調(diào)控機(jī)制上極為相似，且位于體表，易于觀察，在損傷后能自

3、發(fā)再生。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明氨基糖苷類(lèi)抗生素引起的耳毒性機(jī)制與順鉑有所區(qū)別，與新霉素對(duì)比，順鉑能在一定程度上抑制毛細(xì)胞再生，但是順鉑抑制毛細(xì)胞再生的機(jī)制、此過(guò)程涉及因子以及順鉑是否影響毛細(xì)胞再生調(diào)控基因的啟動(dòng)等目前仍然不清楚，所以氨基糖苷類(lèi)藥物耳毒性模型不能代替順鉑耳毒性模型用于順鉑損傷后毛細(xì)胞再生的研究。鑒于此，采用順鉑建立斑馬魚(yú)幼魚(yú)側(cè)線(xiàn)毛細(xì)胞損傷及再生模型，并研究Shh信號(hào)通路在順鉑損傷后斑馬魚(yú)幼魚(yú)側(cè)線(xiàn)毛細(xì)胞再生過(guò)程中的表達(dá)及意義。

4、
　　目的:建立斑馬魚(yú)幼魚(yú)側(cè)線(xiàn)毛細(xì)胞順鉑損傷及再生模型;探究Shh信號(hào)通路在順鉑損傷后斑馬魚(yú)幼魚(yú)側(cè)線(xiàn)毛細(xì)胞再生過(guò)程中的表達(dá)及作用，為探討順鉑損傷后人類(lèi)聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞再生提供借鑒。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)采用50umol/L濃度的順鉑溶液處理受精后5天(5dpf)斑馬魚(yú)幼魚(yú)24h，撤藥后觀察側(cè)線(xiàn)毛細(xì)胞損傷及再生情況。為了探究Shh信號(hào)通路在順鉑損傷后斑馬魚(yú)幼魚(yú)側(cè)線(xiàn)毛細(xì)胞再生過(guò)程的表達(dá)及作用，采用斑馬魚(yú)整體原位雜交技術(shù)檢測(cè)Shh基因及下游

5、重要轉(zhuǎn)錄因子gli1在側(cè)線(xiàn)毛細(xì)胞再生過(guò)程的表達(dá)情況，并且采用Shh信號(hào)通路特異性抑制劑Cyclopamine抑制Shh信號(hào)通路后對(duì)比側(cè)線(xiàn)毛細(xì)胞再生情況。
　　結(jié)果:(1)對(duì)照組斑馬魚(yú)幼魚(yú)側(cè)線(xiàn)SO1、SO2、O1、OC1這四個(gè)神經(jīng)丘毛細(xì)胞平均數(shù)目為9.675±0.64603;移除順鉑后0h，毛細(xì)胞平均數(shù)目為0.2222±0.26352，而在移除順鉑后6h、12h、24h及48h，毛細(xì)胞平均數(shù)目分別為0.6944±0.30046、2.

6、0750±0.55340、4.1818±0.58192、6.5250±0.50621。各時(shí)段毛細(xì)胞恢復(fù)數(shù)占對(duì)照組毛細(xì)胞數(shù)百分比為7.18％、21.45％、43.22％、67.44％。(2)Shh基因和Gli1基因在對(duì)照組斑馬魚(yú)幼魚(yú)側(cè)線(xiàn)神經(jīng)丘都有表達(dá);在移除順鉑后6h，與對(duì)照組相比較，Shh基因表達(dá)量顯著下降，而隨著時(shí)間的推移，Shh基因表達(dá)量逐漸增高，恢復(fù)甚至超過(guò)對(duì)照組;Gli1基因的分布及表達(dá)情況類(lèi)似于Shh基因。(3)Cyclopa

7、mine溶液處理組斑馬魚(yú)側(cè)線(xiàn)SO1、SO2、O1、OC1這四個(gè)神經(jīng)丘毛細(xì)胞平均數(shù)目為2.2955±0.49772，而未采用抑制劑組毛細(xì)胞平均數(shù)目為3.8000±0.94868，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)順鉑可以有效破壞斑馬魚(yú)幼魚(yú)側(cè)線(xiàn)毛細(xì)胞，而側(cè)線(xiàn)毛細(xì)胞在損傷后可以自發(fā)再生，采用斑馬魚(yú)幼魚(yú)建立順鉑毛細(xì)胞損傷及再生模型可行。(2)Shh信號(hào)通路參與了斑馬魚(yú)幼魚(yú)側(cè)線(xiàn)神經(jīng)丘的正常發(fā)育及功能維持。(3)Shh信