建立苦牛大力質量評價指標及對其部分藥效進行研究.pdf

1、目的:建立苦牛大力中芒柄花素和高麗槐素的含量測定方法，苦牛大力總黃酮（the total flavonoids of Radix Millettia Championi，F(xiàn)RMC）的抗炎和提高免疫作用以及對小鼠急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的保護作用及作用機制，并探討FRMC與甜牛大力總黃酮(the total flavonoidsof Radix Millettia Speciosa，F(xiàn)RMS)在抗炎、提高免

2、疫和保護ALI方面作用效果的差異，為苦牛大力在抗炎和提高免疫及保護ALI方面是否可作為甜牛大力的替代或補充品及其藥用價值的開發(fā)應用提供實驗依據(jù)和理論基礎。
　　方法:1.含量測定:采用HPLC法，以芒柄花素和高麗槐素作為標準品，選用Welchrom-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），測定的色譜條件為:流動相為乙腈-水(37.5:62.5)，芒柄花素的檢測波長為248nm、高麗槐素的檢測波長為309 nm，對苦牛大

3、力和甜牛大力中芒柄花素和高麗槐素含量進行測定并比較其含量的差異。
　　2.抗炎和提高免疫作用的研究:采用二甲苯引起小鼠耳腫脹、角叉菜膠導致小鼠足腫脹、醋酸導致小鼠毛細血管通透性增加以及棉球置于小鼠腹股溝誘發(fā)肉芽腫炎癥模型及環(huán)磷酰胺制備小鼠免疫抑制模型來觀察FRMC的抗炎和提高免疫作用，并與FRMS抗炎和提高免疫作用進行比較。
　　3.對ALI的保護作用:鼻腔滴注脂多糖(LPS)制備小鼠ALI模型，測定各組小鼠的肺系數(shù)、肺泡灌

4、洗液(broncholveolar lavage fluid，BALF)中白細胞(white blood cell，WBC)數(shù)目和總蛋白(Pro)含量、肺組織中超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase，SOD)和丙二醛(MDA)含量的變化;用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA法)測定各組小鼠肺組織中白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素-1bata(IL-1β)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達水平;采用蘇木精-伊紅染色法

5、(hematoxylin-eosin staining，HE)觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學的改變。
　　4.對ALI的保護機制研究:采用免疫組化法檢測各組小鼠肺組織中核轉錄因子-κB p65（NF-κB p65）蛋白的表達量;實時熒光定量PCR測定各組小鼠肺組織中IL-6、TNF-α、NF-κB p65及toll樣受體4(TLR4)mRNA的表達量。
　　結果:1.苦牛大力和甜牛大力芒柄花素和高麗槐素的含量情況:苦牛大力＞甜牛大

6、力(P＜0.05)。
　　2.與模型對照組比較，F(xiàn)RMC各劑量組均可明顯抑制二甲苯引起的小鼠耳腫脹、角叉菜引起的小鼠足腫脹，降低醋酸引起腹腔毛細血管通透性的增加，減輕小鼠肉芽腫(P＜0.05或P＜0.01);FRMC中、高各劑量及FRMS各劑量組均可提高免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)，F(xiàn)RMC和FRMS中、高劑量組均可提高免疫抑制小鼠的廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)及遲發(fā)型變態(tài)反應(delayed type hypersensitivity，DTH)

7、程度(P＜0.01或P＜0.05);其中，F(xiàn)RMC低、中劑量組對二甲苯引起的小鼠耳腫脹作用強于FRMS（P＜0.05），而對小鼠肉芽腫抑制作用弱于FRMS(P＜0.05)，在提高廓清指數(shù)方面，F(xiàn)RMC低劑量組強于FRMS(P＜0.05)，F(xiàn)RMC高、中劑量組提高DTH程度較FRMS相應劑量組弱(P＜0.01或P＜0.05)。
　　3.與模型對照組比較，F(xiàn)RMC和FRMS各劑量組可不同程度地降低小鼠肺系數(shù)、Pro滲出量（P＜0.05

8、或P＜0.01），減少小鼠BALF中WBC數(shù)（P＜0.05或P＜0.01），不同程度地增加肺組織中SOD的含量，減少MDA的含量（P＜0.05或P＜0.01），不同程度地減少肺組織TNF-α、 IL-6、IL-1β的分泌量（P＜0.05或P＜0.01）;其中，F(xiàn)RMC高劑量組對提高SOD作用較FRMS弱(P＜0.01)，F(xiàn)RMC中、高劑量組對MDA的降低作用較FRMS弱(P＜0.05)，其他指標FRMC與FRMS相應劑量組作用效果相似(

9、P＞0.05);病理形態(tài)學檢查顯示:FRMC和FRMS均可改善肺組織中炎性細胞浸潤、肺間質增厚、肺水腫等情況，減輕LPS對小鼠肺組織的損害。
　　4.與模型對照組比較，F(xiàn)RMC和FRMS各劑量組均可減少NF-κB p65蛋白在肺組織中的表達水平(P＜0.01);FRMC各劑量組可不同程度地抑制TLR4、NF-κB P65、IL-6和TNF-α mRNA的表達量（P＜0.05或P＜0.01），F(xiàn)RMS各劑量組可以降低肺組織中NF-κ

10、B P65、IL-6和TNF-αmRNA的表達水平(P＜0.05)，F(xiàn)RMS中、高劑量組可抑制TLR4 mRNA的表達水平（P＜0.05或P＜0.01）;與FRMS相應劑量組比較，F(xiàn)RMC低劑量組抑制小鼠肺組織中NF-κB p65蛋白、NF-κB P65及TLR4 mRMA的表達強于FRMS（P＜0.01），F(xiàn)RMC高劑量抑制IL-6 mRMA的表達強于FRMS（P＜0.05），余下指標，F(xiàn)RMC和FRMS作用效果相似(P＞0.05)。