Vero細胞H5N1流感病毒的培養(yǎng)及其后處理工藝研究.pdf

1、近年來我國發(fā)生了多次禽流感疫情，造成了巨大的社會恐慌和經濟損失。疫苗接種是目前預防和控制流感最經濟有效的措施。在我國獲得批準使用的流感疫苗均以雞胚作為病毒生產基質。鑒于雞胚的供應需要較長的時間，不能在短期內提供足夠的疫苗以應對隨時可能爆發(fā)的流感大流行。而Vero細胞能夠利用細胞工廠和微載體-生物反應器系統(tǒng)進行大規(guī)模培養(yǎng)，生產過程易于控制及實現規(guī)?；a，且培養(yǎng)出的流感病毒較雞胚培養(yǎng)的病毒變異小，用其生產出的流感疫苗與當時流行株匹配程度高

2、。因此，開發(fā)Vero細胞大流行流感疫苗顯得尤為必要。
　　在國內外，細胞工廠培養(yǎng)技術已經是非常成熟和普遍的體外大量培養(yǎng)細胞的技術，如培養(yǎng)KMB-17、2BS、MRC-5等細胞。其具有便捷靈活安全的操作方式，較少的占用空間，可控性好，既有優(yōu)于轉瓶的優(yōu)勢，又沒有類似生物反應器的應用限制。本文主要考察了Vero細胞在細胞工廠中的生長情況以及利用細胞工廠培養(yǎng)流感病毒條件的優(yōu)化，篩選出了細胞工廠培養(yǎng)H5N1流感病毒較適培養(yǎng)條件為:胞齡為60

3、～72 h、TPCK-胰酶含量為2μg/ml，MOI為0.1，收毒時間為接種后72 h，培養(yǎng)溫度為33±0.5℃，維持液pH值約為7.6，病毒滴度達到1∶256～1∶1024。免疫熒光檢測發(fā)現H5N1亞型流感病毒能夠較好地感染Vero細胞; H5N1Va流感病毒(A/Anhui/1/2005 va)在Vero細胞上擴增的過程中型別保持不變;基因序列比對結果證實H5N1Va兩個表面抗原基因確實來源于A/Anhui/1/2005(H5N1)

4、。
　　由于Vero細胞為傳代細胞系，生產時存在一些問題，如殘余宿主蛋白可能引起過敏反應以及宿主細胞DNA有致瘤性風險。疫苗生產時需要控制Vero細胞的代次在150代以內，并進行后處理純化以減少殘余Vero細胞DNA和蛋白含量。本文對Vero細胞流感疫苗后處理純化工藝進行了摸索，確定使用0.65、0.45、0.22μm濾芯進行三級過濾澄清、300 KD超濾膜包濃縮、加Benzonase酶37℃處理病毒濃縮液4h、1000 KD超濾