環(huán)狀RNA在腦膠質(zhì)瘤中的差異表達與功能研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤。目前針對膠質(zhì)瘤的治療方法包括手術切除、放射治療及以替莫唑胺為主的化療，縱使經(jīng)過手術及術后的放化療，高級別膠質(zhì)瘤特別是膠質(zhì)母細胞瘤的預后仍非常差，嚴重威脅人類生命健康。隨著醫(yī)學的發(fā)展進步，人們對膠質(zhì)瘤的認識也逐步深入。膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是個極其復雜的過程，闡明膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，進而尋找早期診斷、預后判斷及治療靶點的新的分子標記物具有重要意義。近年來的研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著

2、密切的聯(lián)系。
　　環(huán)狀RNA(circRNA)是一類單鏈的閉合的環(huán)狀非編碼RNA，既沒有5'端，也沒有3'端的多聚A尾。由于它特殊的穩(wěn)定結(jié)構，使它不會被RNA酶降解，在進化上存在保守性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)circRNAs可作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)或miRNA海綿而發(fā)揮重要作用?；赾ircRNAs的這些特點，對circRNAs的研究可能為藥物的開發(fā)提供新思路，為研究生命的進化提供新方向，作為一種生物標志物。
　　隨著

3、高通量測序技術的發(fā)展，運用這一技術篩選出了大量腫瘤中差異表達的circRNAs，并為后續(xù)的深入研究中揭示了部分circRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的重要作用。這些研究主要集中在肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等，circRNAs在膠質(zhì)瘤中的表達及其功能研究較少。因此，我們運用高通量測序技術對5例膠質(zhì)母細胞瘤和5例正常腦組織進行了circRNA測序，構建了膠質(zhì)母細胞瘤的circRNAs表達譜，并比較計算出膠質(zhì)母細胞瘤中差異表達的circRNAs。通過對

4、差異表達的circRNAs生物信息學分析，推測其可能發(fā)揮的作用。從而為闡明膠質(zhì)瘤的分子生物學機制奠定一定的基礎。根據(jù)差異表達的circRNAs的生物信息分析結(jié)果，我們從下調(diào)表達的circRNAs中挑選了一個circRNAs在68例不同級別腦膠質(zhì)瘤和13例正常腦組織中驗證其表達水平，并與膠質(zhì)瘤患者的預后行相關性分析。另外我們利用質(zhì)粒載體構建了過表達質(zhì)粒，并對膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251轉(zhuǎn)染，進行一系列功能學實驗驗證過表達該circRNAs后

5、對膠質(zhì)瘤細胞系的生物學特性的影響，為今后以circRNAs為切入點的膠質(zhì)瘤的診斷與治療進行初步探索。
　　第一部分:環(huán)狀RNA在膠質(zhì)母細胞瘤與正常腦組織中的差異表達及生物信息學分析
　　目的:構建膠質(zhì)母細胞瘤和正常腦組織中circRNAs的表達譜，分析差異表達的circRNAs可能的作用，為后續(xù)靶定研究與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關的circRNAs提供基礎。
　　方法:對5例膠質(zhì)母細胞瘤和5例正常腦組織提取總RNA，使用ci

6、rcRNAEnrichment Kit(cloud-seq,USA)富集circRNAs，用truseq stranded total RNA libraryprep kit(Illumina，San Diego，CA，USA)預處理RNA并構建測序文庫（10個），將文庫變性為單鏈DNA分子，在Illuminaflowcell上捕獲并原位擴增為簇，運用Illumina HiSeq測序儀進行150循環(huán)的circRNAs測序，獲取經(jīng)過質(zhì)控后

7、的雙端reads，用STAR軟件將這些reads比對到參考基因組/轉(zhuǎn)錄組(Hg19)上，運用DCC軟件行circRNAs檢測和鑒定，并運用circBase和circ2Trait數(shù)據(jù)庫對所鑒定的circRNAs進行注釋。使用總reads對每個樣品的原始junction reads進行標準化并行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化。運用t-test計算circRNAs在兩組間差異的顯著性，取差異倍數(shù)大于等于2倍且p≤0.05的circRNAs。對差異circRNA

8、s的來源基因進行GO分析和KEGG通路分析，并用miRNA靶基因預測軟件TargetScan和Miranda進行circRNAs-microRNA相互作用預測，使用Cytoscape軟件構建circRNAs-microRNA網(wǎng)絡圖。
　　結(jié)果:在10個組織標本中共有50386個circRNAs，其中有1411個circRNAs在兩組間表達有顯著性差異，206個circRNAs在GBM組上調(diào)表達，1205個circRNAs在GBM組

9、下調(diào)表達。GO分析顯示在腫瘤組上調(diào)表達的circRNAs在生物學途徑涉及了生物學途徑(BP)35項，細胞組份(CC)31項，分子功能(MF)12條目。下調(diào)表達的circRNAs在BP涉及了663項，CC146項，MF150項。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達的circRNAs沒有富集的信號通路，而下調(diào)表達的circRNAs共有70條信號通路。circRNAs-microRNA相互作用網(wǎng)絡圖顯示，一個circRNAs可對應多個microRNA

10、，而一個microRNA也可以與多個circRNAs有相互作用關系。
　　結(jié)論:(1)在GBM和正常腦組織中circRNAs存在非常大量circRNAs，且存在大量差異表達的circRNAs，這些差異表達的circRNAs可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。(2)差異表達circRNAs的GO分析和KEGG通路分析顯示它們可能參與了信號轉(zhuǎn)導、腫瘤細胞增殖及多種腫瘤相關的生物學過程，總體上反映了circRNAs在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)

11、揮重要的作用。(3)、circRNAs-microRNA網(wǎng)絡圖提示circRNAs與microRNA有著復雜的調(diào)控關系，其具體調(diào)控機制有待進一步研究。
　　第二部分:環(huán)狀RNA circBRAF在不同級別腦膠質(zhì)瘤中的表達及其與預后的關系研究
　　目的:比較circBRAF在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達情況，并分析circBRAF的表達水平與預后的相關性。
　　方法:用realtime PCR的方法檢測circBRAF在68例

12、不同級別腦膠質(zhì)瘤及13例正常腦組織中的表達水平，統(tǒng)計分析其表達水平與患者預后的相關性。
　　結(jié)果: circBRAF的表達水平在正常腦組織中明顯高于腫瘤組織中，且與腫瘤級別呈負相關(p＜0.01)，生存分析顯示circBRAF的表達水平與無進展生存(PFS)及總體生存(OS)呈正相關。
　　結(jié)論:circBRAF的表達量隨腫瘤級別的增高而降低，且與患者預后呈明顯的正相關，因此我們推測circBRAF表達下降促進了膠質(zhì)瘤的發(fā)生

13、。
　　第三部分:環(huán)狀RNA circBRAF在腦膠質(zhì)瘤中的功能研究
　　目的:初步研究探討過表達circBRAF在膠質(zhì)瘤細胞系U251中的功能
　　方法:構建circBRAF過表達質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)染使U251細胞過表達circBRAF基因，運用realtime PCR檢測過表達效率，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24小時后行功能學實驗檢測過表達circBRAF后對U251細胞的生物學特性的影響。
　　結(jié)果:U251細胞轉(zhuǎn)染circBRA