Cx26與PI3K-Akt信號通路相互激活促進EMT介導的NSCLC吉非替尼獲得性耐藥的研究.pdf

1、目的:研究Connexin26(Cx26)對非小細胞肺癌(Non-small-cell lungcancer，NSCLC)上皮間質化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和吉非替尼獲得性耐藥的影響及其分子機制。
　　方法:
　　1.用蛋白免疫印跡(Western blot，WB)、RT-PCR(reverse transcriptionPCR)法檢測4種縫隙連接蛋白(Connexins

2、，Cxs) Cx26、Cx32、Cx31.1及Cx43在4株人NSCLC細胞系HCC827、PC9、A549、NCI-H1299中的表達水平。
　　2.用誘導耐藥的方法，在人NSCLC細胞系HCC827、PC9的培養(yǎng)基中，按濃度梯度逐步增加吉非替尼濃度，以1.0μM的吉非替尼終濃度維持細胞耐藥性，構建吉非替尼誘導耐藥株HCC827 GR和PC9 GR細胞。使用噻唑藍（Tetrazolium-based colorimetric a

3、ssay，MTT）法檢測以上細胞的半數(shù)抑制濃度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）值。
　　3.用熒光示蹤法(parachute assay)檢測人NSCLC細胞株HCC827、PC9及其誘導耐藥株HCC827 GR、PC9 GR細胞間的縫隙連接功能(gapjunctional intercellular communication，GJIC);使用免疫熒光技術(Immunofl

4、uorescence staining，IF)檢測NSCLC細胞株HCC827、PC9及其誘導耐藥株HCC827 GR、PC9 GR細胞中Cx26的蛋白定位。
　　4.用慢病毒(lentivirus)載體技術對人NSCLC細胞中Cx26蛋白表達進行干擾和過表達;用pcDNA3.1-Akt質粒轉染對人NSCLC細胞中Akt蛋白進行過表達，用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002對Akt蛋白表達進行抑制;用WB檢測人NSCLC細

5、胞中Cx26、E-cadherin、vimentin、slug、Akt及p-Akt的表達水平。使用Transwell小室法檢測人NSCLC細胞的遷移、侵襲能力。
　　5.BALB/c裸鼠分別皮下接種200μL1×107個HCC827、HCC827 GR、HCC827 GR-shCx26細胞。當腫瘤體積((長×寬2)/2）達到100 mm3時，分別給予吉非替尼（100 mg/kg/d，灌胃）或LY294002（25 mg/kg，腹腔

6、注射，一周2次）或聯(lián)合給藥。給藥作用15天后處死裸鼠，每3天測量一次腫瘤體積，繪制腫瘤增殖曲線。
　　結果:
　　1.WB和RT-PCR結果顯示，在4株人NSCLC細胞系HCC827、PC9、A549、NCI-H1299中，Cx26、Cx32、Cx31.1和Cx43的表達具有差異性，其中Cx26是主要表達的Cxs亞型，并且Cx26在吉非替尼耐藥細胞株A549、NCI-H1299中表達均高于吉非替尼敏感細胞株HCC827、PC

7、9。
　　2.MTT結果顯示，HCC827、HCC827 GR和PC9、PC9 GR細胞對吉非替尼的IC50值分別為0.06±0.11μM、12.17±0.18μM及0.25±0.07μM、16.51±0.17μM。形態(tài)學顯示，HCC827 GR、PC9-GR細胞表現(xiàn)分散、細長、間質樣細胞形態(tài);上皮標志物E-cadherin表達減少，間質標志物vimentin、slug的表達增多;Transwell實驗結果顯示，HCC827 GR

8、、PC9-GR細胞的遷移、侵襲能力顯著增強;WB結果顯示，HCC827 GR、PC9 GR細胞中Cx26的表達量顯著增多。
　　3.熒光示蹤法結果顯示，以人包皮成纖維細胞(HFFS)作為陽性對照，HFFS細胞用RA（GJIC增強劑）處理后能夠顯著增強細胞間的GJIC功能。但是HCC827、HCC827 GR和PC9、PC9 GR細胞間縫隙連接功能缺失，用RA處理后并未能增強細胞間的GJIC功能。免疫熒光結果顯示，Cx26表達在HC

9、C827、PC9及HCC827 GR、PC9 GR細胞胞漿。
　　4.在吉非替尼敏感株HCC827、PC9細胞上過表達Cx26后，HCC827-Cx26、PC9-Cx26細胞表現(xiàn)分散、細長、間質樣細胞形態(tài);上皮標志物E-cadherin表達減少，間質標志物vimentin、slug的表達增多;Transwell實驗結果顯示，HCC827-Cx26、PC9-Cx26細胞的遷移、侵襲能力顯著增強。MTT結果表明，HCC827-Cx26

10、、PC9-Cx26細胞對吉非替尼的耐藥性顯著增高。體內成瘤實驗顯示，與HCC827-mock、PC9-mock組相比，過表達Cx26使HCC827、PC9組腫瘤體積顯著增大。
　　5.在對吉非替尼耐藥的HCC827 GR、PC9 GR細胞上干擾Cx26的表達后，HCC827 GR-shCx26、PC9 GR-shCx26細胞的分散、細長、間質樣細胞形態(tài)被部分逆轉;上皮標志物E-cadherin表達上調，間質標志物vimentin、

11、slug的表達下降;Transwell實驗結果顯示，HCC827 GR-shCx26、PC9 GR-shCx26細胞的遷移、侵襲能力顯著減弱。MTT結果表明，HCC827GR-shCx26、PC9 GR-shCx26細胞對吉非替尼的敏感性顯著增高。體內成瘤實驗顯示，與HCC827 GR-scramble、PC9 GR-scramble組相比，干擾Cx26使HCC827 GR、PC9 GR組腫瘤體積增大被部分逆轉。
　　6.WB結果

12、顯示，在對吉非替尼敏感的HCC827、PC9細胞中過表達Cx26后，p-Akt的表達量顯著增多;在對吉非替尼耐藥的HCC827 GR、PC9 GR細胞中干擾Cx26后，p-Akt的表達量顯著降低。用LY294002處理HCC827-Cx26、PC9-Cx26細胞后，形態(tài)學結果顯示，LY294002能夠部分逆轉上述細胞的間質樣轉變;上皮標志物E-cadherin表達增多，間質標志物vimentin、slug的表達減少;Transwell實

13、驗結果顯示，LY294002能夠拮抗過表達Cx26對HCC827、PC9細胞的促遷移和促侵襲效應。MTT結果表明，LY294002能夠拮抗過表達Cx26對HCC827、PC9細胞對吉非替尼的耐藥性。體內成瘤實驗顯示，與HCC827-mock、PC9-mock組相比，LY294002處理后能夠抑制過表達Cx26引起的HCC827、PC9組的腫瘤體積的增大。
　　7.在HCC827、PC9細胞中過表達Akt后，HCC827、PC9細胞

14、表現(xiàn)出分散、細長、間質樣細胞形態(tài);上皮標志物E-cadherin表達減少，間質標志物vimentin、slug的表達增多;Transwell實驗結果顯示，過表達Akt后HCC827、PC9細胞的遷移、侵襲能力顯著增強。MTT結果顯示，過表達Akt后HCC827、PC9組對吉非替尼的敏感性顯著降低。在過表達Akt的HCC827、PC9細胞中進一步過表達Cx26蛋白后，能進一步增強上述效應。而在過表達Akt的HCC827、PC9細胞中干擾C

15、x26蛋白的表達后，能夠部分拮抗上述效應。此外，WB結果顯示，在HCC827、PC9、HCC827GR、PC9 GR細胞用特異性PI3K/Akt通路抑制劑LY294002抑制PI3K/Akt通路活性后，Cx26的表達下降;在上述細胞中用質粒瞬轉過表達Akt后，Cx26的表達隨之增多。
　　結論:Cx26上調與非小細胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥呈正相關;Cx26與PI3K/Akt信號通路之間的相互激活促進EMT介導的非小細胞肺癌吉非替尼