非綜合征型視網(wǎng)膜色素變性家系PRPF31基因突變的篩查及功能鑒定.pdf

1、研究背景和目的：
　　視網(wǎng)膜色素變性（Rentinitis pigmentosa，RP，OMIM：268000）是光感受器細(xì)胞（包括視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞）異常而導(dǎo)致的遺傳性視網(wǎng)膜疾病。RP在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率約為1/5000-1/3500；在我國，RP的發(fā)病率也在逐年上升，約為l/l000，是引起失明的重要原因之一。
　　根據(jù)是否同時(shí)伴隨其他眼部癥狀，RP可以分為綜合征型視網(wǎng)膜色素變性（Syndromicretinitis p

2、igmentosa）和非綜合征型視網(wǎng)膜色素變性（Nonsyndromic retinitis pigmentosa，NSRP），其中NSRP約占RP的65％。
　　RP的發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜，涉及多種不同的生物代謝途徑。其致病基因所編碼的蛋白主要參與光傳導(dǎo)、感光細(xì)胞結(jié)構(gòu)的維持以及mRNA剪接等過程。不同生物途徑中各種蛋白的編碼基因突變而使蛋白功能受損，都可能導(dǎo)致光感受器細(xì)胞的異常，引起RP的發(fā)生。
　　2012年，許菲等在一個常

3、染色體顯性遺傳 RP家系的研究中發(fā)現(xiàn) PRPF31基因的7號外顯子上有一個c.544_618del75bp的新發(fā)突變。但是，許菲等的研究選取的家系并不完整，只是該家族大家系中的一小部分；另外由于RP具有極強(qiáng)的臨床和遺傳異質(zhì)性，可能存在新的尚未發(fā)現(xiàn)的致病突變位點(diǎn)；并且許菲等的研究沒有對該c.544_618del75bp缺失突變具體機(jī)制和功能進(jìn)行深入探索。
　　因此，我們對該家系進(jìn)行補(bǔ)充和完善，對許菲的研究結(jié)果在整個大家系中進(jìn)行驗(yàn)證，

4、同時(shí)尋找新的致病突變，進(jìn)一步闡明基因型和表型的關(guān)系，并對c.544_618del75bp缺失突變的功能進(jìn)行初步研究，為RP的分子遺傳機(jī)制及臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。
　　研究對象：
　　對許菲等研究的RP家系進(jìn)行補(bǔ)充和完善，并對該家系成員進(jìn)行了詳細(xì)的病史采集和眼科檢查，對家系內(nèi)患者進(jìn)行了確診。詳細(xì)了解該家系成員的信息后繪制家系系譜。抽取該家系成員外周靜脈血5mL。此外，隨機(jī)選取100名健康個體作為正常對照，抽取外周血5mL

5、。本研究通過了鄭州大學(xué)倫理委員會的審批，所有受試者均知情同意。
　　研究方法：
　　1.本研究采用全血基因組提取試劑盒提取了外周血基因組DNA，對該RP家系成員提取了RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
　　2.對該家系中全部成員和100名健康對照通過sanger測序進(jìn)行PRPF31基因c.544_618del75bp突變位點(diǎn)的測序篩查驗(yàn)證，鑒定該基因型與表型在家系中的共分離。并且對家系內(nèi)患者的基因組cDNA進(jìn)行c.544_6

6、18del75bp突變位點(diǎn)的sanger測序驗(yàn)證。
　　3.對該突變位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)功能分析，并通過SWISS MODEL軟件預(yù)測野生型和突變型PRPF31基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)。
　　4.采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測該家系中患者和正常人的外周血中PRPF31基因mRNA的表達(dá)水平。構(gòu)建攜帶野生型和突變型PRPF31基因的過表達(dá)載體并采用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行提取和純化，其后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過Western blo

7、t檢測野生型和突變型基因編碼蛋白在293T細(xì)胞內(nèi)是否有表達(dá)。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)染野生型和突變型過表達(dá)載體的293T細(xì)胞中檢測PRPF31基因mRNA的表達(dá)水平，驗(yàn)證突變對PRPF31基因功能的影響。
　　5.通過查閱文獻(xiàn)及The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫篩選和mRNA剪切相關(guān)并且在人類外周血中有表達(dá)的RP9、ROM1、SNRNP200和TOPORS等基因。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)在該家系患者和正常

8、人的外周血中檢測這些基因mRNA的表達(dá)水平，并在轉(zhuǎn)染野生型和突變型過表達(dá)載體的293T細(xì)胞中驗(yàn)證這些基因的表達(dá)情況。
　　6.采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。家系內(nèi)患者與健康對照之間mRNA的表達(dá)水平采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，運(yùn)用Bivariate相關(guān)性分析，對家系內(nèi)所有成員中PRPF31基因的mRNA表達(dá)水平與其相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平分別進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0

9、.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.該家系內(nèi)大部分患者都在10歲前發(fā)病，均以夜盲為首發(fā)癥狀，伴有視力有下降、視野缺損等癥狀，眼底檢查表明視盤顏色相對正常，但有不同程度的視網(wǎng)膜色素細(xì)胞萎縮。
　　2.經(jīng)過sanger測序發(fā)現(xiàn)所有患者的DNA和cDNA中都攜帶有PRPF31基因c.544_618del75bp突變。除1例外顯不全成員外，家系內(nèi)正常人和100例健康對照中則沒有檢測到該突變。本研究結(jié)果與許菲等人的研究結(jié)

10、果一致。此外，我們在PRPF31基因上發(fā)現(xiàn)了一個IVS6-78_IVS6-75del4CACA的缺失突變，但所有患者中均未發(fā)現(xiàn)該突變。這兩個缺失突變同時(shí)存在于家系中的1例外顯不全的成員中，并且位于不同的染色體上。家系內(nèi)正常人中IVS6-78_IVS6-75del4CACA缺失突變發(fā)生率為31.4%，且都為雜合突變。100例健康對照有38%的人有IVS6-78_IVS6-75del4CACA突變并且均為雜合突變，其等位基因的頻率為21.5

11、%。
　　3.利用SWISS MODEL對c.544_618del75bp突變型PRPF31基因所編碼的蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測，結(jié)果提示蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了比較明顯的缺失改變。利用Mutation Taster在線軟件對PRPF31基因上的c.544_618del75bp突變位點(diǎn)和IVS6-78_IVS6-75del4CACA突變位點(diǎn)進(jìn)行功能預(yù)測，結(jié)果顯示c.544_618del75bp缺失是一種致病突變，能夠造成氨基酸序列的改變和剪

12、切位點(diǎn)的改變，進(jìn)而可能造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。而IVS6-78_IVS6-75del4CACA位點(diǎn)能夠使剪切位點(diǎn)發(fā)生改變，可能改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
　　4.通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)在家系內(nèi)16例患者與26例正常對照之間對PRPF31基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)患者外周血中PRPF31基因的mRNA表達(dá)水平（0.65±0.40）顯著低于正常對照（1.35±1.15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。構(gòu)建攜帶野生型和突變型

13、PRPF31基因的過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，Western blot檢測到突變型和野生型PRPF31的過表達(dá)載體在293T細(xì)胞內(nèi)能夠正常表達(dá)，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測PRPF31基因的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)野生型和突變型PRPF31基因轉(zhuǎn)染組PRPF31基因mRNA表達(dá)水平顯著高于陰性對照組（P<0.001），且野生型PRPF31基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于突變型（P<0.001）。
　　5.采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-

14、PCR在家系內(nèi)16例患者與26例正常對照之間檢測RP9、ROM1、SNRNP200和TOPORS等基因的mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)患者外周血中RP9和ROM1基因mRNA的表達(dá)水平（分別是0.52±0.34和0.79±0.67）顯著低于正常對照（分別是1.50±1.13和1.74±1.72），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。運(yùn)用Bivariate相關(guān)性分析，對家系內(nèi)39例成員（16例患者與26例正常對照者）的PRPF31基因的mRNA表

15、達(dá)水平與RP9、ROM1基因的mRNA表達(dá)水平分別進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：PRPF31基因與RP9基因的mRNA表達(dá)水平呈顯著的正相關(guān)（r=0.71，P=0.000）。在轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞中對RP9、ROM1、SNRNP200和TOPORS基因的表達(dá)水平進(jìn)行體外驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)突變型PRPF31轉(zhuǎn)染組中RP9的表達(dá)水平低于野生型轉(zhuǎn)染組，但是差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1. PRPF31基因的雜合突變c.544_618

16、del75bp可能是該視網(wǎng)膜色素變性家系的致病突變，而IVS6-78_IVS6-75del4CACA缺失突變可能是一個多態(tài)位點(diǎn)。
　　2. PRPF31基因c.544_618del75bp致病突變能夠降低該基因的mRNA表達(dá)水平，這可能是PRPF31基因c.544_618del75bp突變導(dǎo)致RP發(fā)生的重要機(jī)制。
　　3. PRPF31基因c.544_618del75bp突變能夠使ADRP相關(guān)基因RP9的表達(dá)水平顯著降低，表