創(chuàng)傷性腦損傷后Sirt1和MAPKs信號通路相互作用對星形膠質(zhì)細胞活化的影響.pdf

1、目的:星形膠質(zhì)細胞在創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic braininjury，TBI)后活化并變成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞，它們合成的膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein，GFAP)增多，通過用GFAP免疫組織化學(xué)方法在灰質(zhì)和白質(zhì)內(nèi)可以看到星形膠質(zhì)細胞肥大。星形膠質(zhì)細胞伸出突起，沿著損傷邊界朝著損傷部位遷移。當(dāng)這些突起遇到活化的炎性細胞和浸入的間質(zhì)細胞時，它們限制炎性區(qū)域，但并不能超過損害邊界。在損

2、傷周圍，它們分泌細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)分子，用于形成基膜或重新構(gòu)成膠質(zhì)界膜。在遠離軸突變性的區(qū)域也可有反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞，它們與軸突、神經(jīng)元或小膠質(zhì)細胞之間的細胞間通訊可以成為觸發(fā)因子。
　　Sir2(Silent Information Regulator2)是sirtuin（SIRT）家族最早是1984年在酵母菌中作為一個可保持染色體沉默的高度保守基因組被發(fā)現(xiàn)的。已證實在酵母菌中Sir2

3、的過表達可以通過DNA的修復(fù)延長壽命。Sirtuins歸屬于組蛋白去乙?；?(histone deacetylase，HDAC)家族。SIRT1是哺乳動物Sir2的直系同源物，它是一個細胞核蛋白并且涉及調(diào)節(jié)許多細胞內(nèi)過程，包括凋亡、細胞衰老、內(nèi)分泌信號、糖穩(wěn)態(tài)、老齡化和長壽。在人類和嚙齒類動物中，七種結(jié)構(gòu)和功能不同的組蛋白去乙酰化酶已被確定(SIRT1-SIRT7)。它們分別位于不同的亞細胞區(qū)，包括細胞核、細胞質(zhì)和線粒體等。SIRT1

4、去乙酰酶的活性是通過煙酰胺抑制和通過白藜蘆醇激活。此外，SIRT1蛋白活性可能是通過磷酸化作用調(diào)節(jié)，因為在體外Ser27和Ser47位點可被磷酸化，然而，這些磷酸化位點的功能還沒有被確定。Sirt1可調(diào)節(jié)機體多種器官的壽命。Sirt1在胚胎腦組織中的表達水平特別高，在發(fā)育和成年哺乳動物腦組織中也有表達，提示sirt1對神經(jīng)元進化有影響。Araki等證實，在小鼠神經(jīng)細胞中，Sirt1蛋白能延緩神經(jīng)細胞軸突降解，而這種降解往往發(fā)生于接觸化學(xué)

5、藥物或從細胞體斷離的神經(jīng)細胞軸突，表明Sirt1對神經(jīng)元也有保護作用。Sirt1通過對不同刺激的調(diào)節(jié)參與眾多病理過程，如老化、代謝性疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、心血管功能障礙等，它主要存在于細胞核和細胞質(zhì)中，其激活狀態(tài)可導(dǎo)致其亞細胞定位的轉(zhuǎn)變，其中核質(zhì)穿梭非常。近期研究發(fā)現(xiàn)Sirt1是主要存在于細胞質(zhì)中，而磷酸化Sirt1(p-sirt1)僅局限于核，此外，DNA損傷引起的再分配使Sirt1離開DNA損傷位點的沉默序列和基因啟動子，進而

6、改變在細胞內(nèi)的位置，這些變化可能在SIRT1的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。
　　絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是細胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。細胞外調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulatedkinase，ERK)，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38信號通路是MAPKs家族中的重要成員

7、。研究證實，這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細胞內(nèi)，在將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞及其核內(nèi)，并引起細胞生物學(xué)反應(yīng)（如細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等）的過程中具有至關(guān)重要的作用。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1的去乙酰化和MAPKs(ERK，JNK和p38)的磷酸化之間可以相互作用彼此影響，但具體機制尚未清楚，尤其是其在腦損傷后星形膠質(zhì)細胞活化的作用機制更是研究甚少，因此，本課題就Sirt1和MAPKs信號通路之間相互作用對腦損傷后星形膠質(zhì)

8、細胞活化表達影響的機制進行探究，為腦損傷后膠質(zhì)細胞過度活化導(dǎo)致的神經(jīng)損傷提供新的治療靶點。
　　研究方法:體外實驗:取出生1-3天的小鼠乳鼠大腦皮質(zhì)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，免疫細胞化學(xué)熒光染色GFAP蛋白表達對培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞的純度進行鑒定。IL-1β刺激星形膠質(zhì)細胞活化，應(yīng)用Sirt1激動劑——白藜蘆醇(Resveratrol，Res)，MAPK信號通路抑制劑U0126，SP600126和SB203580分別進行干預(yù)，對照組為同劑量

9、濃度的抑制劑溶劑DMSO。免疫細胞化學(xué)熒光染色對星形膠質(zhì)細胞進行形態(tài)學(xué)檢測，western blot技術(shù)檢測星形膠質(zhì)細胞中GFAP, Sirt1，p-ERK，p-JNK和p-p38的蛋白表達，ELISA檢測活化后星形膠質(zhì)細胞中炎癥因子IL-1β，IL-6和TNFα的含量。
　　體內(nèi)實驗:制各小鼠黑質(zhì)紋狀體通路損傷模型，側(cè)腦室給予白藜蘆醇(Resveratrol，Res)，MAPK信號通路抑制劑U0126，SP600126和SB20

10、3580進行干預(yù)，對照組為同劑量濃度的溶劑DMSO。Western blot技術(shù)檢測損傷周圍組織GFAP, Sirt1和MAPK信號通路中關(guān)鍵蛋白p-ERK，p-JNK和p-p38的經(jīng)時活化表達;免疫組織化學(xué)熒光雙重染色技術(shù)檢測損傷周圍Sirt1和MAPK信號通路中關(guān)鍵蛋白p-ERK，p-JNK和p-p38在星形膠質(zhì)細胞中的活化表達;ELISA檢測損傷周圍組織中炎癥因子IL-1β，IL-6和TNFα的表達量;動物行為學(xué)如平衡木實驗，抓力

11、測試，損傷后神經(jīng)功能評分等檢測損傷后給予白藜蘆醇，MAPK信號通路抑制劑U0126，SP600126和SB203580對神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用Bonferroni檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:體外實驗:1、western blot發(fā)現(xiàn)IL-1β刺激后星形膠質(zhì)細胞GFAP蛋白表達明

12、顯增加，熒光染色顯示IL-1β刺激后星形膠質(zhì)細胞中GFAP陽性表達增強且形態(tài)學(xué)有明顯改變，如胞體肥大，突起減少等符合反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞活化的特征性改變。2、活化后的星形膠質(zhì)細胞中Sirt1蛋白表達明顯減少，且p-ERK，p-JNK和p-p38蛋白表達水平明顯增高。3、應(yīng)用Sirt1激動劑——白藜蘆醇提高Sirt1表達，以及MAPKs信號通路抑制劑，可明顯降低星形膠質(zhì)細胞GFAP水平且胞體肥大、突起縮短變粗減少的細胞形態(tài)明顯改善。4、白藜

13、蘆醇可以提高p-ERK并抑制p-JNK和p-p38蛋白的表達;抑制MAPKs信號通路活化后均可提高Sirt1蛋白的表達，且JNK信號通路抑制劑SP600125提高Sirt1蛋白表達的效果最為顯著。
　　體內(nèi)實驗:western blot結(jié)果顯示損傷后GFAP蛋白表達明顯增高，Sirt1蛋白表達減少，且ERK，JNK，p38信號通路均發(fā)生活化;熒光染色發(fā)現(xiàn)，損傷周圍的星形膠質(zhì)細胞GFAP陽性表達強烈，胞體肥大，突起縮短且減少并向損傷

14、區(qū)域聚集;白藜蘆醇可以提高Sirt1蛋白的表達，減弱損傷周圍星形膠質(zhì)細胞的活化并調(diào)節(jié)ERK，JNK和p38信號通路的活化表達，其中促進ERK信號通路的活化但是抑制JNK和p38信號通路的活化;應(yīng)用MAPKs抑制劑后，在減弱星形膠質(zhì)細胞活化的同時可以提高Sirt1的表達，提示腦損傷后Sirt1和MAPKs信號通路活化具有一定的相互關(guān)聯(lián)，此結(jié)果與體外培養(yǎng)腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞結(jié)果一致;ELISA檢測結(jié)果顯示損傷后IL-1β，IL-6和TNFα表

15、達量明顯增加，應(yīng)用白藜蘆醇或者MAPKs信號通路抑制劑后IL-1β，IL-6和TNFα表達量明顯減少，提示提高Sirt1表達或者抑制MAPKs信號通路活化可以抑制損傷導(dǎo)致的炎癥因子表達;動物行為學(xué)檢測結(jié)果顯示，白藜蘆醇或者MAPKs信號通路抑制劑，均對損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)具有一定的促進作用。
　　結(jié)論:1、IL-1β可刺激體外培養(yǎng)的腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞活化。2、活化的星形膠質(zhì)細胞Sirt1表達降低，ERK，JNK和p38信號通路發(fā)生