Gabra-3基因A至IRNA編輯位點的鑒定及其分子機制的研究.pdf

1、由腺苷酸脫氨基酶(ADAR)介導的A（腺嘌呤核苷酸）至I（次黃嘌呤核苷酸）的RNA編輯作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后加工方式越來越受到人們的關注。ADAR通過自身的雙鏈結(jié)合域識別并結(jié)合pre-mRNA形成的雙鏈區(qū)，催化特定A脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)镮，進而使遺傳信息在RNA水平發(fā)生改變。對于蛋白編碼基因，RNA編輯可能最終引起蛋白質(zhì)功能的改變、增加生物體中蛋白質(zhì)的多樣性以及表達調(diào)控的復雜性。A至I的RNA編輯大量發(fā)現(xiàn)于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的離子通道基因，γ-

2、氨基丁酸受體就是其中之一。研究表明，ADAR1和ADAR2共同作用于小鼠GABAA基因α3亞基(Gabra-3)外顯子9自身形成的RNA莖環(huán)結(jié)構，將其中一個A位點脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)镮，密碼子的改變使原先編碼的異亮氨酸(I)轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼?M)，該編輯過程對小鼠GABAA受體的生物學功能有非常重要的作用。
　　 對Gabra-3基因A至IRNA編輯的研究表明：人、小鼠、狗等哺乳動物以及雞的I/M位點都受到編輯，而兩棲綱的蛙和魚綱的河豚魚

3、中此位點為組成型的G（鳥嘌呤核苷酸）。本研究為了進一步確定該位點RNA編輯發(fā)生的進化位置，對進化關系介于雞和蛙之間的爬行綱物種蜥蜴、平嘴鱷魚、中華烏龜，兩棲綱物種東方蠑螈、墨西哥鈍口螈Gabra-3基因的RNA編輯位點進行了鑒定。結(jié)果表明，三種爬行綱動物的腦組織中Gabra-3基因的I/M位點都發(fā)生了編輯，而兩棲綱的東方蠑螈、墨西哥鈍口螈在該位點無編輯跡象?；谝陨辖Y(jié)果我們推斷：在進化史上該位點G較早出現(xiàn)，當兩棲類分化出蛙形目和有尾目后

4、，該位點受特定選擇壓力的影響發(fā)生了G至A的突變，但隨后的爬行綱中產(chǎn)生的A至I RNA編輯在一定程度上消除了G至A突變對該基因的影響，從而維持了基因編碼產(chǎn)物的保守性。此外，本研究還對哺乳綱、鳥綱、爬行綱各物種該位點的編輯效率進行了定量分析。結(jié)果顯示，在哺乳綱到兩棲綱約4.5億年的進化歷程中，該位點的編輯效率具有從高到低直至0的變化趨勢。
　　 Gabra-3基因外顯子9自身形成的RNA二級結(jié)構編碼16個氨基酸，是目前發(fā)現(xiàn)最小的受A

5、至I RNA編輯影響的天然莖環(huán)結(jié)構，是研究RNA編輯調(diào)控機制的理想模型。本研究的另一部分內(nèi)容是構建無義突變的Gabra-3迷你基因，運用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄生成RNA分子。這些RNA分子可以形成與自然界能夠發(fā)生編輯的Gabra-3相似的RNA莖環(huán)結(jié)構。利用非洲爪蟾卵母細胞表達系統(tǒng)，我們對突變后的迷你基因I/M位點的編輯情況進行了體內(nèi)檢測。結(jié)果表明I/M位點周圍的序列以及莖環(huán)結(jié)構都對編輯效率有顯著影響。我們用RNA化學藥劑結(jié)構分析法

6、對人野生型Gabra-3迷你基因、以及突變體GC/UC、GC/CU、GC/CC的二級結(jié)構進行分析，結(jié)果表明這四個RNA分子真實的二級結(jié)構支持先前預測的最佳結(jié)構，這反映了我們基于預測二級結(jié)構提出結(jié)論的可靠性。但我們就受編輯與非編輯莖環(huán)之間的結(jié)構差異無法總結(jié)出規(guī)律用以推斷I/M位點的編輯與否，鑒于此我們推測：盡管RNA分子的一級、二級結(jié)構都將影響ADARs的識別，但RNA序列在體內(nèi)真實的三級構象信息可能最終決定著與ADARs是否互作。

7、>　　 此外，我們還設計了溫度控制實驗，通過改變RNA折疊溫度調(diào)節(jié)最終形成的莖環(huán)結(jié)構，從而調(diào)控I/M位點的編輯。當溫度升高到37℃時，原本不能被ADARs識別的GC/UC、GC/CC突變迷你基因莖環(huán)結(jié)構發(fā)生了編輯。同時，我們也證實了GC/UC、GC/CC突變迷你基因在37℃時形成的結(jié)構的確與25℃形成的不同。
　　 我們將編輯前、后的小鼠Gabra-3全長基因與小鼠Gabraβ、Gabaraγ共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，使用全細