土槿皮乙酸逆轉胃癌SGC7901-ADR細胞耐藥的作用機制.pdf

1、目的:化學治療是中晚期胃癌患者治療的主要手段。但是，由于腫瘤耐藥的發(fā)生，化療藥物的療效不能夠有效發(fā)揮。土槿皮乙酸(Pseudolaric acid B，PAB)是從土槿皮——松科植物金錢松(Pseudolarix kaempferi Gorden)的干燥根皮或近根樹皮中分離出的新型二萜酸化合物。研究表明PAB可抑制胃癌、肝癌、結腸癌等腫瘤細胞增殖、誘導細胞周期阻滯及細胞凋亡，同時發(fā)現(xiàn)其能夠逆轉P-gp介導的肝癌耐藥株QGY-TR50細胞

2、的化療耐藥作用，并抑制肝癌耐藥株裸鼠移植瘤的生長;同時其也能夠抑制結腸癌耐藥細胞增殖，對抗結腸癌細胞對5-FU耐藥性。本課題組前期實驗研究證實PAB具有逆轉胃癌化療耐藥作用，本實驗研究將進一步深入探討PAB逆轉胃癌耐藥的分子機制，并關注其對多藥耐藥基因的影響。
　　研究方法:1、MTT法檢測細胞增殖抑制率。收集處于對數(shù)生長期SGC7901及SGC7901/ADR細胞，調整細胞懸液濃度后接種于96孔板，細胞貼壁后，實驗組加入不同濃度

3、的ADR，對照組加等量不含藥物的培養(yǎng)基，并設立調零孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，MTT法檢測各孔吸光度值（OD值），計算ADR對兩種細胞的增殖抑制率。2、免疫細胞化學檢測MRP1蛋白的表達。人胃癌多藥耐藥SGC7901/ADR細胞爬片，細胞貼壁后分為以下各組:PAB組、ADR組及PAB聯(lián)合ADR組，同時設立不加藥物處理的SGC7901/ADR細胞對照組，各處理因素作用24h后，4％多聚甲醛固定，以免疫細胞化學法檢測各組細胞內MRP1的表達，顯微

4、鏡下觀察染色效果，顯微鏡下(×400)攝片。3、Western blot方法檢測MRP1、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSKβ蛋白的表達。將SGC7901/ADR細胞分為PAB、ADR及PAB聯(lián)合ADR組，同時設立不加藥物處理的SGC7901/ADR細胞對照組，各處理因素作用24h后，收集細胞，提取蛋白，用Western blot方法檢測MRP1、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSKβ蛋白的表達水平。4、Real-Time

5、 PCR法檢測MRP1mRNA、MDR1mRNA的表達水平。以不同濃度PAB作用于人胃癌耐藥細胞SGC7901/ADR，同時分別設立不加藥物的SGC7901及SGC7901/ADR細胞組，收集細胞，提取RNA，進行RNA反轉，cDNA擴增，確認Real-Time PCR的擴增曲線和溶解曲線，記錄CT值，采用2^-△△Ct法公式計算倍數(shù)。5、統(tǒng)計學處理。本實驗所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS21.0分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，兩樣本均

6、數(shù)比較應用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用方差分析(One-Way ANOVA)，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1、胃癌MDR細胞系的確認。MTT法檢測ADR化療藥對SGC7901/ADR細胞和SGC7901細胞的增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)ADR對SGC7901/ADR細胞和其親本SGC7901細胞的抑制作用有顯著差異(P＜0.05)，提示SGC7901/ADR細胞具有多藥耐藥屬性。2、免疫細胞化學檢測MRP1的表達水平。免疫細胞化

7、學檢測PAB、ADR、PAB聯(lián)合ADR對SGC7901/ADR細胞中MRP1的表達影響，結果顯示對照組細胞中的MRP1高表達，染色呈棕黃色，PAB組中的MRP1表達略下降，ADR組中可見MRP1表達下調，PAB聯(lián)合ADR給藥組中可見MRP1的表達顯著下調，染色呈淺黃色。3、Western blot檢測MRP1、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSKβ蛋白的表達。Western blot檢測 PAB、ADR及兩者聯(lián)合給藥對SGC790

8、1/ADR細胞中各種蛋白表達水平的影響，結果顯示與對照組相比MRP1、p-GSKβ、p-AKT蛋白的表達水平在PAB組、ADR組及PAB聯(lián)合ADR組中均依次下調(P＜0.05)，而AKT、GSK3β的表達水平未見明顯改變，差異不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。4、Real-Time PCR法檢測不同濃度PAB作用下耐藥細胞MRP1mRNA、MDR1mRNA的表達水平。結果顯示，與SGC7901細胞相比，胃癌耐藥系SGC7901/ADR細

9、胞高表達耐藥基因MDR1及MRP1(P＜0.05);且給予不同濃度PAB(5μ mol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)作用于胃癌耐藥細胞后，與未加藥物處理的SGC7901/ADR對照組相比，隨著PAB作用濃度增加，耐藥基因MDR1及MRP1的基因表達在各組中均依次下調，各處理組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:PAB通過作用于MRP1分子達到逆轉胃癌化療耐藥作用;其逆轉胃癌化療耐藥作用可