羧肽酶Y標記蛋白質(zhì)羧基端方法的優(yōu)化及其應用.pdf

1、目的：
　　蛋白質(zhì)水解作為一種重要的翻譯后修飾，在細胞凋亡、腫瘤細胞轉移等生物化學過程中起著極其重要的作用。鑒定蛋白質(zhì)水解位點可以進一步加深我們對這些生化過程的認識。近年來，鑒定蛋白質(zhì)水解的氨基端蛋白質(zhì)組學方法層出不窮，但羧基端組學方法卻很少。本課題中，我們首先將對蛋白質(zhì)羧基端生物酶標記（ProC-TEL）和親和純化效率兩個方面進行優(yōu)化，將優(yōu)化后的ProC-TEL和正向分離羧基端多肽方法應用到E.coli全蛋白樣品中，以期對蛋白質(zhì)

2、復雜樣品的羧基端多肽進行正向分離富集并用質(zhì)譜鑒定。其次，將優(yōu)化后的ProC-TEL和正向分離的方法應用到藥物誘導凋亡的多發(fā)性骨髓瘤細胞樣品中，鑒定凋亡過程中蛋白質(zhì)的水解。最后，探索數(shù)個羧肽酶Y突變體在ProC-TEL中的應用，探尋轉肽酶活性更好的羧肽酶Y突變體，從而對蛋白質(zhì)樣品進行高效的羧基端標記。
　　方法：
　　蛋白質(zhì)C端羧肽酶Y標記方法是首個正向標記分離蛋白質(zhì)C端多肽的方法。本課題中，通過優(yōu)化該方法中生物素標記反應的p

3、H值以獲得標記產(chǎn)物均一的實驗條件；通過研究SDS含量對生物素標記效率的影響，對羧肽酶Y標記技術進行優(yōu)化；通過對E.coli全蛋白復雜樣品羧基端親和標記、親和純化和質(zhì)譜鑒定，對復雜樣品中蛋白質(zhì)水解位點進行高通量檢測；利用臺盼藍染色法、CCK-8檢測法和Western blotting檢測5，6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB）對多發(fā)性骨髓瘤細胞發(fā)生凋亡的調(diào)控；聯(lián)合優(yōu)化后的ProC-TEL技術、親和純化和質(zhì)譜鑒定對藥物誘導的多

4、發(fā)性骨髓瘤OPM2細胞凋亡過程中的水解進行質(zhì)譜鑒定；通過羧肽酶Y突變體的構建、表達及其在生物素標記實驗中的應用，篩選可能提高生物素標記效率的突變體羧肽酶Y，進行羧肽酶Y介導的生物素標記實驗。
　　結果：
　　1）通過對比模型肽Ac-ASLTDYVKSYGA在不同pH條件下生物素標記樣品的MALDI-TOF-MS檢測結果發(fā)現(xiàn)：在pH=11.5的反應條件下，生物素標記產(chǎn)物較為均一。
　　2）通過增加生物素標記體系中反應緩沖

5、液中SDS的含量和甲基酯化反應后復溶緩沖液中SDS的含量，從Western blotting檢測和銀染結果發(fā)現(xiàn)，當反應體系中SDS含量為0.5％時為最佳生物素標記條件。
　　3）通過MALDI-TOF-MS以及LC-MS/MS結果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的ProC-TEL技術聯(lián)合親和純化以及質(zhì)譜分析能夠正向分離檢測單一蛋白質(zhì)C端多肽。
　　4）用優(yōu)化后的羧基端標記方法來標記E.coli復雜蛋白樣品羧基端，純化后共鑒定到了120多個蛋白質(zhì)

6、羧基端多肽。
　　5）用優(yōu)化后的ProC-TEL技術檢測100?M DRB加藥處理6 h誘導的多發(fā)性骨髓瘤OPM2細胞凋亡過程中的水解，DMSO對照組共檢測到了81個生物素標記多肽，DRB加藥組共鑒定出了88個生物素標記多肽，并發(fā)現(xiàn)多個凋亡酶水解底物蛋白。
　　6）在探索實驗中，發(fā)現(xiàn)盡管野生型以及突變體羧肽酶Y可以在原核表達體系中成功表達，但其介導的生物素標記效率并沒有明顯提高。
　　結論：
　　優(yōu)化后的ProC

7、-TEL技術可以更好地聯(lián)合親和純化及質(zhì)譜鑒定對蛋白質(zhì)的羧基端多肽進行正向分離和鑒定。在E.coli復雜蛋白樣品中鑒定出了31個蛋白質(zhì)內(nèi)部水解位點，有多個水解蛋白可能在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成以及氧化還原反應中發(fā)揮著重要的作用。由于產(chǎn)生的新的N端多肽太長或太短，這些蛋白質(zhì)水解后約有48%的水解位點不能被氨基端組學的方法鑒定出來。其次，優(yōu)化后的ProC-TEL在多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡過程中鑒定出了11個新的凋亡酶水解位點。
　　綜上所述，本課題優(yōu)