下調ZEB1表達抑制黑色素瘤干細胞的致瘤性和肺轉移研究.pdf

1、惡性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是來源于黑色素細胞的一種惡性腫瘤。在過去的20多年中，世界范圍內惡性黑色素瘤的發(fā)病率呈逐步增高的趨勢。皮膚是惡性黑素色瘤的主要發(fā)病部位，占皮膚惡性腫瘤的死亡率約70％，也可起源于眼、鼻腔等處，其高度侵襲與轉移的能力是惡性黑色素瘤患者死亡的主要原因，早期可轉移至肺、腦等部位，晚期隨體循環(huán)擴散至全身。而上皮-間充質轉換(epithelialmesenchymal transition

2、，EMT)在其中扮演著重要角色， EMT被認為是啟動腫瘤侵襲轉移的重要事件。研究表明，歷經EMT的惡性黑色素瘤細胞能從腫瘤的原發(fā)灶逃離，侵襲到周圍其他組織，經過血液或淋巴途徑到達更遠處的器官形成轉移灶。新近研究還發(fā)現(xiàn)，有EMT表型的惡性黑色素瘤細胞更具耐藥性、免疫抑制及類干細胞等特性。在EMT的發(fā)生發(fā)展過程中最主要的調控對象是E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)。該蛋白是維持上皮細胞特性的重要分子，E-cadherin的丟失是EMT的

3、一個重要特征，若E-cadherin表達下降，細胞則會呈現(xiàn)許出多非上皮細胞的特征，如細胞極性丟失，細胞間的粘附性降低，轉變成更易發(fā)生轉移的間質細胞，而表達波形蛋白（Vimentin）上調，這些蛋白表達改變是EMT的一個重要標志。因此，探究EMT的發(fā)生和調控機制，對于尋找治療腫瘤細胞轉移的靶點有重要意義。
　　隨著分子生物學的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中有極少數(shù)細胞具有類于細胞的特性:能無限增殖、不斷分化，對化療、放療不敏感，而這些細

4、胞成為腫瘤發(fā)生、侵襲轉移和復發(fā)的關鍵細胞，即腫瘤干細胞(tumor stem ceils，TSCs)或癌干細胞(cancer stem cells，CSCs)。近來對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的研究表明，鋅指結合蛋白（1zinc finger E-box-binding protein1，ZEB1）在腫瘤轉移過程中發(fā)揮著重要作用。ZEB1是鋅指結構轉錄因子中的E盒結合鋅指蛋白，它不僅能調節(jié)EMT的發(fā)生和發(fā)展，還能通過調節(jié)細胞周期、細胞凋亡、衰老、

5、侵襲轉移和間質血管生成等，進而調節(jié)腫瘤的進展。本課題組前期實驗結果顯示:降低B16F10細胞中ZEB1的表達，可在一定程度上降低B16F10細胞在體外的克隆形成能力、增殖能力、耐藥性、侵襲轉移能力及體內致瘤能力，但對B16F10細胞中CSCs的影響如何，期待進一步探討。正因如此，本研究選擇小鼠黑色素瘤細胞系B16F10細胞中CD133+ CD44+CSCs作為研究對象，將其從B16F10細胞中分離，探討下調ZEB1的表達對CD44+CD

6、133+CSCs的致瘤性和肺轉移的影響，從而為惡性黑色素瘤的治療提供新的思路。
　　目的:
　　探討下調黑色素瘤CSCs中ZEB1的表達對其致瘤性和肺轉移的影響，為尋找黑色素瘤新的治療靶點提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.將構建好的靶向鼠ZEB1基因的pSUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA干擾質粒通過脂質體轉染B16F10細胞，并通過G418篩選穩(wěn)定轉染細胞株。
　　2.用免疫磁選技術從穩(wěn)定轉染p

7、SUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA的B16F10克隆中分離獲取ZEB1-shRNA2CD133+CD44+CSCs以及scramble-shRNA CD133+CD44+CSCs;從B16F10細胞中分選出CD133+CD44+CSCs。
　　3.通過劃痕實驗、侵襲性實驗，體內致瘤性、荷瘤鼠生存實驗及肺轉移實驗，綜合分析下調ZEB1表達后對B16F10 CD44+CD133+ CSCs的致瘤性和肺轉移的影響。
　　

8、4.用2×104 B16F10 CD44+CD133+CSCs、ZEB1-shRNA CD44+CD133+CSCs、scramble-pSUPER-EGFP CD44+CD133+CSCs分別攻擊C57BL/6小鼠，通WesternBlotting實驗和免疫組化實驗分別檢測瘤組織中EMT相關蛋白ZEB1，E-cadherinN-cadherin及Vimentin的表達。
　　結果:
　　1.分離出經G418篩選出穩(wěn)定轉染p

9、SUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA的B16F10細胞克隆;
　　2.用免疫磁選技術成功分離出ZEB1-shRNA CD133+CD44+CSCs、scramble-pSUPER-EGFP CD133+CD44+CSCs以及B16F10 CD133+CD44CSCs;劃痕實驗、侵襲性實驗、小鼠體內致瘤性和肺轉移實驗結果顯示:B16F10 CD44+CD133+CSCs及scramble-pSUPER-EGFP CD44+C

10、D133+CSCs的侵襲性和轉移性以及致瘤性均高于ZEB1-shRNA CD44+CD133+CSCs，差異有顯著性意義(P＜0.01)。
　　3.qRT-PCR法、Western Blotting及免疫組化檢測瘤組織中EMT相關蛋白顯示:ZEB1-shRNA CD44+CD133+CSCs的靶基因ZEB1表達減低，間質型蛋白Vimentin和N-cadherin表達下降，而上皮型蛋白E-cadherin的表達升高;肺組織黑色素瘤