MicroRNA-375在非小細胞肺癌發(fā)生腦轉移中的作用和機制探索.pdf

1、目前，肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌從病理類型上分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)。NSCLC中約50％會發(fā)生腦轉移(BM)。本研究通過組織中檢測miR-375在NSCLC腦轉移患者中的表達，并與未發(fā)生腦轉移的NSCLC患者對照，明確miR-375在腦轉移中的作用，為NSCLC腦轉移提供早期診斷的分子標記物;通過生存及預后研究，明確miR-375在NSCLC患者尤其是NSCLC腦轉移患者中的預后重要性。

2、通過構建miR-375慢病毒載體并轉染至非小細胞肺癌細胞中，形成穩(wěn)定克隆，探討miR-375對非小細胞肺癌細胞生物學特性的影響，并探討miR-375在NSCLC發(fā)生發(fā)展及發(fā)生腦轉移中的可能機制，為以后開展動物實驗提供較明確的研究方向，未來可能為NSCLC腦轉移的治療提供靶點。
　　目的:
　　(1)檢測miRNA-375在非小細胞肺癌腦轉移和非小細胞肺癌未發(fā)生腦轉移患者組織中的表達差異，明確miRNA-375在非小細胞肺癌發(fā)

3、生腦轉移中的作用，并分析miRNA-375在NSCLC患者和NSCLC腦轉移患者預后中的作用。
　　(2)通過構建miR-375和anti-miR-375的病毒質粒，轉染至非小細胞肺癌細胞系中，研究miR-375對非小細胞肺癌細胞生物學特性的影響。
　　(3)通過檢測miR-375下游蛋白的表達，探索miR-375在非小細胞肺癌及發(fā)生腦轉移中的可能機制。
　　方法:
　　(1)MiR-375作用研究收集30例非小

4、細胞肺癌腦轉移患者腫瘤組織標本（包括原發(fā)肺癌組織和腦轉移瘤組織）及癌旁組織標本，通過實時熒光定量逆轉錄PCR方法(quatitive Real-time PCR，qRT-PCR)檢測miR-375在非小細胞肺癌腦轉移患者肺部原發(fā)灶、腦轉移灶、癌旁組織中的表達情況;收集30例非小細胞肺癌未發(fā)生腦轉移患者的肺癌原發(fā)灶、癌旁組織標本，qRT-PCR檢測miR-375的表達。以上根據(jù)組織來源可分為四組來研究miR-375的表達水平，即NSCLC

5、腦轉移患者腦部轉移灶、NSCLC腦轉移患者肺部癌組織、NSCLC未發(fā)生腦轉移患者肺部癌組織及癌旁組織組。通過t-檢驗比較miR-375在NSCLC腦轉移和NSCLC未發(fā)生腦轉移患者中表達水平的統(tǒng)計學差異。
　　(2)統(tǒng)計方法研究生存、預后及NSCLC腦轉移相關分子的探索通過方差分析研究miR-375的表達與患者臨床病理特征（分期、淋巴結轉移、腦轉移）的關系。Log-rank檢驗和Kaplan-Meier生存曲線比較總生存時間與mi

6、R-375表達的關系。應用多因素COX回歸模型明確NSCLC患者和NSCLC腦轉移患者預后影響因素。PCR法檢測EGFR、K-ras突變，免疫組化SP法檢測VEGF、MMP-9的表達，應用卡方檢驗明確EGFR突變、K-ras突變、VEGF表達、MMP-9表達與腦轉移的關系，并應用t-檢驗分析EGFR突變、K-ras突變、VEGF表達、MMP-9表達與miR-375表達的關系。
　　(3)通過EcoRⅠ和BamHⅠ酶切及連接后產生攜

7、帶miR-375-EGFP、anti-miR-375-EGFP和EGFP三個質粒，用HIV包被及轉染HEK-293T細胞，后侵染非小細胞肺癌A549細胞，篩選出3個抗性克隆A549-miR375-GFP、A549-anti-miR375-GFP、A549-GFP，并用A549作為空白對照。通過培養(yǎng)和篩選形成，形成4組穩(wěn)定的細胞系。MTT法測定細胞增殖，通過Transwell侵襲和遷移實驗、劃痕試驗研究miR-375對非小細胞肺癌細胞生物

8、學特征的影響。
　　(4)應用體外成管實驗明確miR-375的作用機制，Western blot法檢測下游VEGF、MMP-2、MMP-9、EGFR的表達，探索miR-375在非小細胞及腦轉移發(fā)生發(fā)展中的可能機制。
　　結果:
　　(1)MiR-375在非小細胞肺癌腦轉移灶、非小細胞肺癌腦轉移患者肺部原發(fā)癌組織、非小細胞未發(fā)生腦轉移患者原發(fā)肺癌組織、癌旁組織表達量分別為:0.28±0.05，0.47±0.06，0.71

9、±0.13，1.00±0.17。每兩組之間的差別均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與NSCLC未發(fā)生腦轉移的患者相比，NSCLC腦轉移患者miR-375的表達水平呈明顯下調，并且同一NSCLC腦轉移患者miR-375在腦轉移灶中的表達低于肺部原發(fā)癌組織，且二者差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;NSCLC未發(fā)生腦轉移患者原發(fā)肺癌組織中miR-375的表達明顯低于癌旁正常組織（P＜0.01）。
　　(2)MiR-375的低表達與NSCL

10、C患者的分期晚和腦轉移灶數(shù)目增多相關。對于該研究60例NSCLC患者來說，miR-375低表達組OS明顯短于高表達組，且二者差別具有統(tǒng)計學意義(log-rank test P＜0.01);同樣，對于NSCLC腦轉移患者來說，miR-375低表達組生存時間明顯短于高表達組(log-rank test P＜0.05)。MiR-375的表達是NSCLC患者獨立的預后因子。與NSCLC腦轉移相關的分子為VEGF和MMP-9的表達，而EGFR和K

11、-ras突變與腦轉移無明顯相關;VEGF和MMP-9在miR-375低表達的患者中呈明顯過表達，而EGFR和K-ras突變與miR-375的表達水平無關。
　　(3)通過穩(wěn)定轉染，篩選并培養(yǎng)成功以下四個A549細胞系:A549-miR-375-GFP、A549-anti-miR-375-GFP、A549-GFP和A549。MTT增殖實驗:A549-miR-375-GFP組細胞的增殖率較A549-GFP(Control)組和A549

12、空白對照組明顯降低，且差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而A549-anti-miR-375-GFP組較空白對照組和Control組增殖率明顯升高(P＜0.01)?？瞻讓φ战M和陰性對照組（Control組）二者無明顯差別(P＞0.05)。而觀察72小時熒光顯微鏡下細胞增殖最快的為A549-anti-miR-375-GFP組，最慢的為A549-miR-375-GFP組。
　　(4)Transwell侵襲實驗結果顯示，A549細胞能

13、侵襲穿越基質膠。A549-miR-375-GFP組穿膜細胞數(shù)較少，為75.12±6.21，明顯低于空白組(125±10.27)和Control組(129.51±8.28)(P＜0.05);A549-anti-miR-375-GFP組穿膜細胞數(shù)最多，為199.67±9.23，明顯高于空白組和Control組(P＜0.05)?？瞻捉M和Control組差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　(5)Transwell遷移實驗結果顯示，A5

14、49-miR-375-GFP組穿膜細胞數(shù)較少，為50.33±9.32，低于空白組（108±9.38）和Control組（110±7.82）(P＜0.05);A549-anti-miR-375-GFP組穿膜細胞數(shù)最多，為178±10.89，明顯高于空白組和Control組(P＜0.05)?？瞻捉M和Control組差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　(6)劃痕實驗:A549-miR-375-GFP組、A549-anti-miR37

15、5-GFP、A549-GFP三組分別用100ul無菌槍頭垂直劃痕，記為0小時，24小時候觀察劃痕區(qū)發(fā)現(xiàn)A549-anti-miR375-GFP劃痕區(qū)最小，細胞幾乎全部侵入;而A549-miR-375-GFP組劃痕區(qū)最大，細胞遷入明顯最慢，而A549-GFP組劃痕區(qū)范圍居以上二者中間。
　　(7)體外成管實驗:細胞系放入細胞培養(yǎng)箱中，觀察成管，1周后發(fā)現(xiàn)3D成像，A549--miR375-GFP和A549-GFP組3D成像未發(fā)現(xiàn)成管

16、現(xiàn)象，而A549-anti-miR375-GFP3D成像成管較多。
　　(8)Western Blot檢測EGFR、VEGF、MMP-2、MMP-9的表達:VEGF、MMP-2、MMP-9在PC14/B中呈明顯高表達，而在PC14中呈低表達。A549細胞系中，A549-miR-375-GFP組VEGF、MMP-2、MMP-9呈低表達，而在A549-anti-miR375-GFP組中VEGF、MMP-2、MMP-9呈明顯過表達，另外

17、A549-GFP組和A549組VEGF、MMP-9無明顯差別，而MMP-2在A549-GFP組中表達較A549高。EGFR在PC14和PC14/B中無明顯差異，并且在A549細胞各組之間表達無明顯差別。
　　結論:
　　1.本研究表明miR-375與NSCLC腦轉移明顯相關，miR-375的下調可作為預測NSCLC腦轉移的因子，可用于篩查出腦轉移高危人群。MiR-375有望在早期診斷中發(fā)揮作用。
　　2.MiR-375

18、的表達與分期晚和腦轉移明顯相關;MiR-375在NSCLC和NSCLC腦轉移患者中表達水平越低，生存時間越短，并且miR-375的表達水平是NSCLC患者的獨立預后因子。
　　3.MiR-375的下調可促進非小細胞肺癌細胞的增殖、侵襲、遷移及血管生成，miR-375可能通過血管生成途徑與非小細胞肺癌增殖、侵襲甚至腦轉移相關。MiR-375將來可能為非小細胞肺癌腦轉移的治療提供了新的靶點或新的治療藥物。
　　4.EGFR突變和