天樓解毒消腫散的抗菌作用及其對糖尿病足大鼠EPCs、AR、VEGF mRNA影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　天樓解毒消腫散治療糖尿病足療效確定，本研究旨在建立糖尿病足大鼠模型，通過天樓解毒消腫散外敷糖尿病足大鼠患處，觀察糖尿病足大鼠潰瘍愈合情況及相關(guān)指標(biāo)變化，與正常組、模型組、莫匹羅星組、如意金黃散組進(jìn)行比較，從而進(jìn)一步探討天樓解毒消腫散的抗菌作用及其作用機制，為其更好的運用于臨床，為糖尿病足的的防治提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　實驗一：將50只SD大鼠隨機選取10只作為正常對照組，其余40只隨機分為4組，采用

2、高脂高糖飼料聯(lián)合不同劑量STZ溶液腹腔注射的方法制造糖尿病大鼠模型，采用燙傷法制造糖尿病足大鼠模型。監(jiān)測糖尿病造模大鼠第3天、7天、10天、14天、28天各組大鼠的一般狀況、大鼠死亡率及血糖濃度變化，同時觀察燙傷后糖尿病足大鼠及正常創(chuàng)傷組第3天、7天、10天、28天各組大鼠創(chuàng)面愈合率，由此得到能真實模擬糖尿病足疾病與癥狀表現(xiàn),且死亡率低，具有較好重復(fù)性的的糖尿病足模型的造模方法，為后期實驗提供依據(jù)。
　　實驗二：采用平皿打孔法，選

3、用糖尿病足大鼠足潰瘍處分離出的常見致病的需氧菌、厭氧菌及真菌涂布于培養(yǎng)基表面、打孔，觀察各組抑菌圈大小，分別與慶大霉素、甲硝唑、咪康唑比較，探討天樓解毒消腫散的抗菌作用。
　　實驗三：60只SD大鼠隨機選取12只作為正常對照組，其余48只采用高脂高糖飼料聯(lián)合40mg/kgSTZ溶液腹腔注射制造糖尿病大鼠模型，同時采用燙傷法制備糖尿病足大鼠模型。12只正常對照組大鼠則腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。造模成功的糖尿病足大鼠隨機

4、分為模型組、天樓解毒消腫散組、莫匹羅星組、如意金黃散組，每組12只。天樓解毒消腫散組予以天樓解毒消腫散直接撒于糖尿病足局部，外用無菌紗布包扎固定；莫匹羅星組予以莫匹羅星濕敷包扎糖尿病足局部，以覆蓋整個潰瘍面為度；如意金黃散組予以如意金黃散適量涂抹于患處或用凡士林調(diào)和后攤于紗布上貼患處；模型組采用生理鹽水紗布外敷換藥；正常組不予以特殊處理。傷口每天換藥1次，治療2周。觀察各組大鼠創(chuàng)面面積大小，取大鼠血清3ml，1000rpm離心20min

5、提取血清，按照ELISA試劑盒說明，檢測治療后各組大鼠血清CRP、IL-6、MMP9、HIF-1α、VEGF水平。
　　實驗四：采用高頻彩超置大鼠右后肢足背，觀察治療后各組大鼠足背動脈管徑及Vp、Vd、Vm、RI、PI值的變化。
　　實驗五：取足背動脈2mm，4℃多聚甲醛固定，免疫組化檢測治療后各組大鼠足背動脈VEGF、HIF-1α蛋白的表達(dá)及MVD值。
　　實驗六：取足部潰瘍組織少許，RT-PCR檢測治療后各組大鼠潰

6、瘍組織VEGFmRNA表達(dá)。
　　實驗七：抗凝管腹主動脈取血10ml，提取單核細(xì)胞層，加 PBS緩沖液至6ml，等分為兩份，一份加入 DIL-Ac-LDL，37℃避光孵育90min后，加FITC標(biāo)記的荊豆凝集素10ug/ml，37℃避光孵育1小時，激光共聚焦鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞；另一份分別加入FITC標(biāo)記的CD34和APC標(biāo)記的CD133單克隆抗體各10ul，流式細(xì)胞儀檢測治療后各組大鼠外周血EPCs計數(shù)。
　　實驗八：取足部潰瘍

7、組織少許，迅速放入冷凍管中液氮凍存，后移至-80℃冰箱備用，高效液相法檢測各組大鼠潰瘍組織AR活性。
　　實驗九：取足背動脈2mm，一部分4℃多聚甲醛固定，另取一部分體積不超過1×1×1mm3足背動脈，迅速投入電鏡固定液，觀察各組大鼠HE染色及足背動脈微觀結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果：
　?。?）實驗一，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)實驗結(jié)果選用高脂飼料聯(lián)合STZ40mg/kg腹腔注射及燙傷法制備糖尿病足大鼠模型，可真實模擬糖尿病足疾病與

8、癥狀表現(xiàn),且死亡率低，具有較好重復(fù)性。
　?。?）實驗二結(jié)果顯示，60例分泌物中共培養(yǎng)出病原菌93株，其中需氧菌52株（55.9％），厭氧菌29株（31.2%）,真菌12株（12.9%）。天樓解毒消腫散對需氧菌、厭氧菌、真菌均高度敏感，其中對銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌敏感性優(yōu)于慶大霉素（P＜0.01或P＜0.05），對脆弱類桿菌、變形梭形菌敏感性優(yōu)于甲硝唑（P＜0.01或 P＜0.05），對白色念珠菌敏

9、感性優(yōu)于咪康唑（P<0.05）。
　?。?）實驗三結(jié)果顯示，治療2周后，與模型組比較，天樓解毒消腫散組、莫匹羅星組及如意金黃散組潰瘍面積均明顯縮?。≒＜0.01），天樓解毒消腫散組療效更佳（P＜0.01）。與正常組相比，模型組 CRP、IL-6、MMP9水平明顯升高（P＜0.01）；經(jīng)過藥物干預(yù)后，天樓解毒消腫散組、莫匹羅星組、如意金黃散組均能不同程度下調(diào)血清CRP、IL-6、MMP9水平（P<0.01）。與正常對照組比較，模型組

10、大鼠血清HIF-1α、VEGF含量稍有增高（P<0.01）；與模型組相比，天樓解毒消腫散組、莫匹羅星組、如意金黃散組大鼠 HIF-1α、VEGF均較模型組明顯升高（P<0.01），天樓解毒消腫散組尤甚（P＜0.01）。
　?。?）實驗四結(jié)果顯示，糖尿病足模型組大鼠血管內(nèi)徑較正常組變細(xì)，血流頻譜可見雙相波或三相波，收縮期峰值流速(Vp）、舒張期血流速度（Vd）、平均血流速度（Vm）較正常組均減慢，搏動指數(shù)（PI）降低，阻力指數(shù)（RI

11、）升高，P＜0.05，與相關(guān)報道結(jié)果相同。與模型組比較，天樓解毒消腫散組、莫匹羅星組和如意金黃散組血管內(nèi)徑變化不明顯（P>0.05），但 Vp、Vd、Vm流速增快，PI升高，RI降低，P＜0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義，且天樓解毒消腫散組較莫匹羅星組和如意金黃散組明顯（P＜0.05）。
　?。?）實驗五結(jié)果顯示，正常組足背動脈VEGF、HIF-1α蛋白及MVD值幾乎無表達(dá)，模型組VEGF、HIF-1α蛋白及MVD值表達(dá)稍有增強（P＜0.

12、05）；天樓解毒消腫散、莫匹羅星、如意金黃散干預(yù)可不同程度升高 VEGF、HIF-1α蛋白表達(dá)及 MVD值（P＜0.05）；以天樓解毒消腫散組尤為明顯（P＜0.05）。
　?。?）實驗六結(jié)果顯示，正常對照組大鼠VEGFmRNA少量表達(dá)， 模型組潰瘍組織 VEGFmRNA表達(dá)稍有增強（P＜0.01）；與模型組相比，天樓解毒消腫散組、莫匹羅星組、如意金黃散組能不同程度升高 VEGFmRNA表達(dá)（P＜0.01），天樓解毒消腫散

13、組優(yōu)于各對照組（P﹤0.01）。
　?。?）實驗七結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組外周血EPCs計數(shù)下降（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組相比，天樓解毒消腫散組、莫匹羅星組、如意金黃散組均能不同程度提高大鼠外周血EPCs計數(shù)（P＜0.01），天樓解毒消腫散組優(yōu)于各對照組（P﹤0.01）。
　?。?）實驗八結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組潰瘍組織AR活性升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組相比，天樓解

14、毒消腫散組、莫匹羅星組、如意金黃散組均能不同程度降低其AR活性（P＜0.05或P＜0.01），天樓解毒消腫散組優(yōu)于如意金黃散組（P﹤0.05）。
　　（9）實驗九結(jié)果顯示，HE結(jié)果示：與正常對照組相比，模型組血管內(nèi)可見明顯的動脈粥樣硬化斑塊，管腔不規(guī)則狹窄等。天樓解毒消腫散組較模型組足背動脈病變程度較輕，內(nèi)膜較光滑，未見粥樣硬化斑塊，脂質(zhì)沉積及浸潤表現(xiàn)不明顯，但與正常組比較，內(nèi)皮細(xì)胞排列稍有不整齊，莫匹羅星組、如意金黃散組介于模型

15、組和天樓解毒消腫散組之間。電鏡下顯示：與正常對照組相比，模型組可見內(nèi)彈性膜不連續(xù)，基底膜多處斷裂，內(nèi)皮細(xì)胞呈乳頭狀凸起，排列不均，可見較大面積的內(nèi)皮細(xì)胞損傷性病變等病變；天樓解毒消腫散組較模型組明顯減輕，內(nèi)彈性膜連續(xù)，莫匹羅星組、如意金黃散組介于模型組與天樓解毒消腫散組之間。
　　結(jié)論：
　?。?）糖尿病足模型的建立，以高脂飼料聯(lián)合 STZ40mg/kg腹腔注射及燙傷法制備糖尿病足大鼠模型最為穩(wěn)定，死亡率低。
　?。?

16、）糖尿病足大鼠常合并足部感染，天樓解毒消腫散對需氧菌、厭氧菌、真菌均具有一定抗菌作用。
　　（3）糖尿病足模型組大鼠足部潰瘍愈合延緩，天樓解毒消腫散能使足背潰瘍面積縮??；糖尿病足模型組大鼠血清CRP、IL-6、MMP9水平升高，天樓解毒消腫散能明顯降低血清CRP、IL-6、MMP9水平；糖尿病足大鼠血清HIF-1α、VEGF含量稍有升高，天樓解毒消腫散能明顯上調(diào)血清HIF-1α、VEGF水平。
　　（4）糖尿病足大鼠足背動脈

17、收縮期峰值流速（Vp）、舒張期血流速度（Vd）、平均血流速度（Vm）減慢，搏動指數(shù)（PI）降低，阻力指數(shù)（RI）升高，天樓解毒消腫散能使Vp、Vd、Vm流速增快， PI升高，RI降低。
　?。?）糖尿病足大鼠足背動脈 VEGF、HIF-1α蛋白表達(dá)及 MVD值僅輕度升高，天樓解毒消腫散能明顯提高足背動脈VEGF、HIF-1α蛋白表達(dá)及MVD值。
　　（6）糖尿病足大鼠潰瘍組織 VEGFmRNA表達(dá)稍升高，天樓解毒消腫散能有效

18、激活VEGFmRNA表達(dá)，使VEGFmRNA高表達(dá)。
　　（7）糖尿病足大鼠外周血 EPCs計數(shù)下降，天樓解毒消腫散能有效提高EPCs計數(shù)。
　　（8）糖尿病足大鼠潰瘍組織 AR活性升高，天樓解毒消腫散能降低其AR活性。
　?。?）糖尿病足模型組大鼠足背動脈管腔不規(guī)則增厚，有斑塊生產(chǎn)，且內(nèi)膜不連續(xù)，天樓解毒消腫散能明顯改善足背動脈微觀結(jié)構(gòu)。
　　（10）通過上述9點，我們認(rèn)為天樓解毒消腫散能有效改善糖尿病足大鼠足