具有肝實質細胞線粒體靶向功能的納米遞釋系統(tǒng)的研究.pdf

1、惡性腫瘤的防治始終是生命科學研究領域的一個難點。本論文根據(jù)腫瘤局部和線粒體的生理特點要求，設計了兩種新型的多功能高分子材料N-甘草次酸-酸敏感橋-聚乙二醇-殼聚糖衍生物(N-glycyrrhetinic acid(GA)-polyethylene glycol(PEG)-chitosanderivatives, NGPC)和N-季銨-殼聚糖衍生物(N-quaternary ammonium-chitosanderivatives, NQ

2、C)，并以此為構筑單元，以馬錢子堿（Brucine）為模型藥物，構建新型多功能納米藥物遞釋系統(tǒng)（MNPs）。在該系統(tǒng)中，聚乙二醇具有較長的親水鏈，可以在納米粒周圍形成水化層，減少血液中巨噬細胞的吞噬，延長遞釋系統(tǒng)在體內循環(huán)時間，同時對季銨正離子起屏蔽作用，減少其在生理環(huán)境中的毒性。水化層表面的甘草次酸具有肝實質細胞主動靶向的功能，當載體系統(tǒng)被內吞進入到肝細胞的內涵體/溶酶體后，由于微環(huán)境 pH值的降低，納米粒表面的水化層隨著 GA-PE

3、G脫落而消失，裸露出帶季銨正離子的正電荷殼聚糖納米粒，同時亞胺基團產(chǎn)生強烈的質子海綿效應，逃逸出溶酶體，通過正負電荷的吸引濃集于線粒體表面，釋放出藥物，抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡。
　　在課題組前期研究的基礎上，本課題首先用離子交聯(lián)法制備了載馬錢子堿的殼聚糖多功能釋系統(tǒng)(Brucine/MNPs)，以及分別由NGPC和NQC為構筑材料制備的參比制劑(Brucine/NGPC-NPs和Brucine/NQC-NPs),對其外

4、觀形態(tài)、粒徑分布、Zeta電位、包封率、載藥量、水化層厚度、體外釋放及質子海綿效應等理化性質進行了詳細考察。結果顯示，Brucine/MNPs的包封率為68.53±2.42％，載藥量為6.01±0.27%，粒徑為185.3±6.9nm，并且Brucine/MNPs保持著與空白MNPs相當?shù)?pH響應的電荷翻轉能力和內體逃逸能力，透射電鏡照片下觀察Brucine/MNPs為球形，分散較好，與納米粒徑儀測定粒徑基本相當。體外釋放表明，Bru

5、cine/MNPs在pH7.4和pH4.5下的釋放行為基本一致，都具有緩釋作用。
　　以溶液劑和Brucine/NQC-NPs作為參比制劑，對Brucine/NGPC-NPs和Brucine/MNPs在小鼠體內的組織分布行為進行了考察，以相對攝取率(Relative ratio, Re)和峰濃度比(Concentration ratio, Ce)等為評價指標，評價其對肝組織的靶向性。研究結果顯示，Brucine/NGPC-NPs和

6、Brucine/MNPs具有較強的肝靶向性，以AUC0-t計算，二者的Re值分別是Brucine/NQC-NPs的4.89倍和5.02倍，Ce值分別是Brucine/NQC-NPs的2.49倍和2.57倍，其肝靶向效率和相對靶向效率也都顯著提高，具有較強的肝組織選擇性。
　　以人肝癌 HepG2細胞為細胞模型，考察濃度、時間、溫度對其細胞攝取的影響，并對其細胞攝取機制進行初步探討。結果發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞對各制劑的攝取均具有時間和

7、濃度依賴性，且對Brucine/NGPC-NPs和Brucine/MNPs的攝取明顯強于Brucine/NQC-NPs和Brucine solution。為了進一步研究其被細胞內化的機制，考察甘草次酸和各種內吞抑制劑對細胞攝取的影響，發(fā)現(xiàn) HepG2細胞對Brucine/MNPs的攝取過程需要轉運蛋白的參與，且主要通過表面的甘草次酸配體與肝細胞表面的甘草次酸受體結合的方式來增加在靶細胞的濃集，之后通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞路徑被細胞內化進入

8、細胞內涵體/溶酶體。采用激光共聚焦顯微鏡定性觀察Brucine/NGPC-NPs、Brucine/NQC-NPs和Brucine/MNPs在細胞內的轉運過程，并結合HPLC檢測HepG2細胞線粒體內Brucine的累積量，定量考察Brucine/MNPs的線粒體靶向作用。研究表明，與NGPC-NPs和NQC-NPs相比，MNPs具有顯著的內涵體/溶酶體逃逸能力和線粒體靶向作用。
　　考察了四種Brucine制劑的體外抗腫瘤活性，并

9、對其促腫瘤細胞凋亡機制進行了初步探討，結果表明，在各給藥濃度下，載藥納米制劑均表現(xiàn)出了較強的殺死腫瘤細胞的能力，且Brucine/MNPs明顯強于其它制劑，細胞總凋亡率增加，結合透射電鏡觀察和流式細胞儀發(fā)現(xiàn)，線粒體出現(xiàn)了明顯的腫脹和變形，并伴隨著線粒體膜電位的降低和細胞色素 C的釋放，且載體的引入并沒有改變細胞周期的變化，細胞周期仍被阻滯在G2期。上述結果表明，多功能納米載藥系統(tǒng)不僅能夠促進腫瘤細胞的攝取，還能有效地實現(xiàn)藥物的細胞內轉運

10、，促進腫瘤細胞的凋亡，增強藥物對腫瘤細胞的殺傷力。
　　建立Heps異位荷瘤小鼠模型，考察MNPs的體內抗腫瘤藥效學，結果顯示，Brucine/MNPs在有效抑制腫瘤生長的同時，可以顯著延長荷瘤小鼠的生存時間，腫瘤組織病理切片顯示，經(jīng)Brucine/MNPs治療后，腫瘤壞死面積最大，凋亡細胞占細胞總數(shù)的比例增加，Cleaved caspase-3活化檢測結果表明相較于其它組，Brucine/MNPs組有大量的Cleaved cas

11、pase-3蛋白表達，進而活化一系列與細胞凋亡相關的酶，導致更多的腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮更強的抗腫瘤效應。
　　本論文構建的智能型線粒體靶向納米載藥系統(tǒng)，針對肝組織細胞的表面特性和腫瘤細胞微環(huán)境pH的變化，發(fā)生了在體的高度響應，增加了藥物在肝組織的蓄積和肝腫瘤細胞的攝取，實現(xiàn)了藥物在細胞內的有效傳遞和線粒體的定位釋放，抑制了腫瘤細胞的生長，提高了抗腫瘤效果，降低了有毒性中藥抗腫瘤有效成分的毒副作用，為線粒體靶點藥物提供了安全、高效的載