HLA新等位基因的確認、序列分析及其噬菌體展示單克隆抗體的制備.pdf

1、人類主要組織相容性復合體(Major Histocompatibility Complex，MHC)位于人類第6對染色體短臂6P21.31-21.33，由一組緊密聯(lián)鎖的復等位基因位點組成。其全長3.6Mb～4Mb，約占整個人類基因組3×109bp DNA的0.13％左右。該復合體編碼人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)，包含蛋白編碼基因位點超過150余個，約占整個人類基因組已知約3.2萬個表達基因的0

2、.5％左右。
　　MHC是迄今所知人類最復雜、最具多態(tài)性的免疫遺傳系統(tǒng)，也是人類基因組中已知基因最密集的區(qū)域。在人類基因組計劃(the Human Genome Project，HGP)開始之前，HLA基因復合體即是整個人類基因組中研究最充分的片段。作為人類基因組計劃的重點，MHC成為1999年人類基因組計劃中第一個完成全長測序的基因區(qū)域。其后，MHC區(qū)域基因數據不斷獲得更新。根據2009年Shiina等進行的統(tǒng)計，在總共3.78

3、Mb的MHC區(qū)域內，已確認基因位點更新為253個。包括HLA基因45個，非HLA基因208個。
　　MHC作為人類已知最復雜、最具多態(tài)性的基因區(qū)域，具有高度多態(tài)性。這種多態(tài)性表現(xiàn)為其主要基因位點含有大量的復等位基因，且等位基因的分布具有明顯的種族和地區(qū)差異，不同地區(qū)、不同人群中各等位基因的頻率各不相同。截止2017年，國際免疫遺傳學信息系統(tǒng)數據庫(IMGT/HLA)已公布HLA等位基因16，755個[12]。其中HLA-Ⅰ類等位基

4、因12351個，包括HLA-A等位基因3913個，HLA-B等位基因4765個，HLA-C等位基因3510個。HLA-Ⅱ類等位基因4404個，包括HLA-D RB1等位基因2058個。HLA的這種高度多態(tài)性顯示了遺傳背景的多態(tài)性和復雜性。它是人類在進化過程中抵御不良環(huán)境因素的一種適應性表現(xiàn)，使人類具有更大的抵抗入侵病原體的能力，對維持種群的生存與延續(xù)具有重要的生物學意義。
　　近二十年來，隨著分子生物學技術與HLA DNA測序分型

5、技術應用的不斷發(fā)展與成熟，HLA新等位基因的發(fā)現(xiàn)進入快速發(fā)展期。隨著中華骨髓庫(CMDA)的建立與HLA分型數據的增加以及SBT(Sequencing Based Typing)測序分型技術的建立，在中國人群中不斷發(fā)現(xiàn)新HLA等位基因。
　　HLA抗體作為HLA應用研究的重要組成部分，對于HLA臨床表型分析及移植排斥監(jiān)測具有重要意義。HLA抗體早期來源主要為妊娠、輸血等同種免疫。雜交瘤單克隆抗體技術建立后，其成為制備HLA抗體的主

6、要來源。
　　噬菌體抗體庫(phage antibody library)技術又稱噬菌體展示抗體文庫(phage-display antibody library)技術，是繼雜交瘤單克隆抗體技術之后，免疫抗體制備技術發(fā)展史上的又一重要技術飛躍。噬菌體抗體庫技術是由噬菌體展示技術發(fā)展而來，是噬菌體展示技術和抗體庫技術相結合而發(fā)展出的一項新型抗體制備技術。
　　噬菌體抗體庫技術從根本上改變了傳統(tǒng)雜交瘤單克隆抗體的制備流程，繞過了

7、雜交瘤細胞融合和選擇性克隆化等流程，大大縮短了制備周期，增殖周期從數月可縮短至數周，極大地提高了制備效率;其抗體庫容量可擴大達到106～109個克隆;并可直接獲得抗體的基因序列，并可對其進行進一步基因工程改造。在HLA單克隆抗體應用研究領域，噬菌體展示抗體技術研究尚未見報道。
　　我們自2008年起至今已發(fā)現(xiàn)確認HLA新等位基因33例，均獲得WHO HLA因子命名委員會的正式命名。在論文第一部分，進行了6個新等位基因的鑒定，并對其

8、變異序列的可能來源進行分析，對其編碼蛋白空間分子結構的改變進行初步分析。
　　在論文第二部分，利用原核表達系統(tǒng)，對4例A*24新等位基因:HLA-A*24∶191、A*24∶224、A*24∶225、A*24∶257、A*24∶02∶01（作為標準A*24等位基因）以及A*24總變異序列（包含A*24∶224、A*24∶225、A*24∶257這3個新等位基因的變異序列）編碼分子的重鏈胞外結構域進行原核表達，然后通過噬菌體展示抗體

9、庫技術，針對HLA-A*24∶191新等位基因編碼的氨基酸變異位點，進行單克隆抗體制備，作為今后對這些新等位基因的分子結構和表達進行進一步的分析和了解的研究工具。
　　第一部分HLA新等位基因的發(fā)現(xiàn)鑒定及序列分析
　　目的：
　　發(fā)現(xiàn)、鑒定分析新的HLA等位基因序列
　　方法：
　　1.基因分型:樣本HLA-A、B、DRB1位點常規(guī)高分辨分型采用HLA PCR-SBT(sequence-based typi

10、ng)測序分型與基于Luminex液相流式平臺的熒光微珠PCR-rSSO（reverse sequence-specific oligonucleotide probe，序列特異性寡核苷酸探針反向雜交）分型方法相結合的方法進行。
　　2.基因序列分析:HLA常規(guī)高分辨分型異常樣本采用單等位基因特異性單鏈雙向測序技術，使用HLAssureTM SE SBT HLA Typing Kit測序試劑，對每個位點上的兩條單倍體上的雜合等位基

11、因，分開進行單獨正反雙向測序。
　　3.新等位基因編碼蛋白分子空間結構預測分析:使用SWISS-MODEL同源建模、Phyre2及RasMol和RCSB PDB Protein Workshop軟件，對新等位基因編碼蛋白分子空間結構進行模擬分析。
　　結果:
　　1.00333號樣本采用Luminex液相流式平臺rSSO熒光磁珠反向雜交分型復核，結果顯示為A*02∶06∶01+A*68∶01∶02，但伴有FP＃022、

12、FN＃072假反應探針的異常結果。
　　該樣本SBT測序復核結果顯示A位點序列最匹配結果為A*02∶03∶01+A*68∶01∶02，但存在2個堿基差異，即在第2外顯子第98位核苷酸為A(A+A)而非W(A+T)，第102位核苷酸為Y(C+T)而非W(A+T)。
　　單等位基因雙向測序鑒定，表明該樣本A*02∶03∶01等位基因第2外顯子第98位核苷酸發(fā)生T-＞A堿基替代，導致第9位密碼子由TTC變?yōu)門AC，其編碼氨基酸由苯

13、丙氨酸(Phe，F(xiàn))變?yōu)槔野彼?Tyr，Y);第102位核苷酸發(fā)生A-＞C堿基替代，導致相應的第10位密碼子由ACA變?yōu)锳CC，但其編碼氨基酸未發(fā)生改變。
　　2.01513樣本采用rSSO熒光磁珠流式反向雜交分型,結果顯示為罕見型DRB1*15∶66+DRB1*14∶05∶01/02，并存在FP＃516/517假陽性探針的異常結果。
　　SBT測序分型復核結果顯示DRB1位點最匹配結果為DRB1*14∶05∶01+DRB1

14、*15∶66，但存在2個堿基差異，即在第2外顯子第258位核苷酸為T(T+T)而非Y(T+C)，第261位核苷酸為Y(C+T)而非T（T+T），存在2個堿基差異替代。
　　單等位基因雙向測序鑒定，表明該樣本DRB1*15∶66等位基因第2外顯子第258位核苷酸堿基發(fā)生C-＞T堿基替代，結果導致相應的第57位密碼子GAC→GAT;第261位核苷酸發(fā)生T-＞C堿基替代，結果導致相應的第58位密碼子GCT→GCC。但這兩個密碼子的堿基改

15、變都未造成編碼氨基酸改變。
　　3.00791號樣本SBT測序分型結果顯示A*24∶02∶01序列第2外顯子第215位核苷酸為R(A+G)而非G(G+G)，存在1個堿基差異替代。
　　單等位基因雙向測序鑒定，表明該樣本第2外顯子第215位核苷酸堿基發(fā)生G-＞A堿基替代，導致相應的第48位密碼子發(fā)生CGG→CAG，其編碼氨基酸由精氨酸（Arg，R）→谷氨酰胺(Gln，Q)。
　　4.00059樣本SBT測序分型結果顯示A

16、位點序列最匹配結果為A*24∶02∶01+A*33∶03∶01，但在第2外顯子第178位核苷酸為Y(C+T)而非T(T+T)，存在1個堿基差異替代。
　　單等位基因雙向測序鑒定，表明該樣本A*24∶02∶01等位基因第2外顯子第178位核苷酸堿基發(fā)生T＞C堿基替代，結果導致相應的第36位密碼子發(fā)生TTC→CTC改變，其編碼氨基酸由苯丙氨酸(Phe,F)變?yōu)榱涟彼?Leu,L)。
　　5.00290樣本SBT測序分型結果顯示A

17、位點序列最匹配結果為A*24∶198+A*33∶03∶01，但第2外顯子第155位核苷酸為W(A+T)而非T(T+T)，存在1個堿基差異替代。
　　單等位基因雙向測序鑒定，表明該樣本A*24∶198等位基因上第2外顯子第155位核苷酸堿基發(fā)生了T-＞A堿基替代，結果導致相應的第28位密碼子由GTG→GAG，其編碼氨基酸由纈氨酸(Val，V)變?yōu)楣劝彼?Glu，E)。
　　6.00550樣本Luminex液相流式平臺rSSO熒

18、光磁珠反向雜交分型，結果顯示為罕見型A*24∶02∶15+A*02∶01∶01，并存在FP＃043假陽性探針的異常結果。
　　SBT測序分型復核顯示A位點序列最匹配結果為A*24∶156+A*02∶01∶01，但第2外顯子第256位核苷酸為S(C+G)而非G(G+G)，存在1個堿基差異替代。
　　單等位基因雙向測序鑒定，表明該樣本A*24∶156等位基因上第2外顯子第256位核苷酸堿基發(fā)生了G-＞C堿基替代，結果導致相應的第

19、62位密碼子由GAG→CAG，其編碼氨基酸由谷氨酸(Glu，E)變?yōu)楣劝滨０?Gln,Q)。
　　以上等位基因序列經IMGT/HLA數據庫BLAST檢索確認后，遞交美國NCBIGenBank數據庫，獲得注冊序列號，然后經EMBL-EBI申報，分別被世界衛(wèi)生組織(WHO)HLA因子命名委員會正式命名為HLA-A*02∶355（00333樣本）、DRB1*15∶06∶02（01513樣本）、A*24∶224（00791樣本）、A*24

20、∶225（00059號樣本）、A*24∶257（00290樣本）和A*24∶191（00550號樣本）。
　　結論
　　發(fā)現(xiàn)鑒定6例HLA新等位基因，分別被WHO HLA命名委員會命名為HLA-A*02∶355（00333樣本）、HLA-DRB1*15∶06∶02（01513樣本）、HLA-A*24∶224(00791樣本)、HLA-A*24∶225（00059號樣本）、HLA-A*24∶257（00290樣本）和HLA-A

21、*24∶191（00550號樣本）。
　　第二部分通過噬菌體展示技術制備新等位基因A*24∶191編碼蛋白單克隆抗體
　　第一章A*24蛋白分子重鏈胞外結構域的原核蛋白表達純化
　　目的:對A*24新等位基因重鏈胞外結構域進行表達純化，制備原核表達可溶性蛋白。
　　方法:
　　1.以A*24∶19、A*24∶224、A*24∶225、A*24∶257新等位基因序列作為模板序列進行蛋白表達。根據新等位基因A*

22、24∶224、A*24∶225、A*24∶257核苷酸序列變異位置，設計將以上3個新等位基因核苷酸變異匯總為A*24總變異序列（A*24Total Mutation），將A*24∶02∶01作為A*24標準蛋白序列。
　　2.基因模板采用重疊延伸PCR法，制備模板基因。使用NcoⅠ、XhoⅠ酶切pET-28a(+)載體。載體連接使用同源重組無縫克隆技術，將目的基因連接入載體進行表達。
　　3.轉化使用TOP10感受態(tài)細胞，將

23、載體轉化入TOP10感受態(tài)細胞。并進行克隆鑒定。
　　4.目的蛋白誘導表達采用Transetta DE3細胞作為表達感受態(tài)細胞，對目的蛋白進行表達。
　　5.通過超聲裂解包涵體，使用Ni-NTA Resin柱純化法進行可溶性蛋白純化。
　　6.SDS-PAGE電泳鑒定表達蛋白質量。
　　結果:
　　1.模板重疊延伸PCR鑒定、菌液PCR鑒定結果顯示PCR產物大小正確，符合預期標準。
　　2.陽性克隆測

24、序結果顯示插入基因片段與目的基因序列一致無誤。
　　3.SDS-PAGE電泳及Western Blot結果顯示表達蛋白大小正確，該表達可溶性蛋白可用于下一步單克隆抗體鑒定。
　　第二章 HLA-A*24∶191編碼蛋白噬菌體展示庫單克隆抗體制備
　　目的:
　　通過噬菌體展示技術制備A*24新等位基因單克隆抗體
　　方法:
　　1.使用A*24∶191變異序列合成多肽免疫5只小鼠，共計4次，其間隔時間

25、為分別為3/2/2周。免疫完成7天后ELISA檢測小鼠血清效價。3天后進行免疫終加強。
　　2.終加強免疫完成第2天提取小鼠脾臟RNA，反轉錄cDNA。
　　3.使用25對輕鏈基因引物及50對重鏈基因引物，分別擴增輕鏈及重鏈基因。
　　4.使用ApaLⅠ和AscⅠ內切酶，對輕鏈基因及pHD載體質粒進行酶切。使用NotⅠ和SiiⅠ內切酶酶切重鏈基因。
　　5.將輕鏈基因酶切片段與載體質粒連接，脫鹽純化后電轉SS32

26、0細胞。
　　6.測定輕鏈子庫庫容并進行測序鑒定，鑒定合格后提取輕鏈子庫質粒。
　　7.使用NotⅠ和SfiⅠ內切酶進行酶切輕鏈子庫質粒。然后將已酶切之重鏈基因連接導入輕鏈子庫。
　　8.測定Fab抗體庫庫容，挑取Fab抗體文庫菌落，進行測序驗證，對其抗體基因完整性與文庫多態(tài)性、抗體基因種源及其Germline亞型進行分析。
　　9.Fab抗體庫經復蘇、接種培養(yǎng)、輔助噬菌體侵染、篩選擴培，完成噬菌體展示抗體庫營救

27、擴培。
　　10.進行噬菌體海選、淘選，營救與擴增，ELISA初篩及確認，陽性克隆抗體誘導表達。
　　11.菌液裂解上清與A*24∶191表達蛋白進行免疫印跡法檢測。
　　結果：
　　1.小鼠免疫血清檢測結果顯示3號小鼠免疫血清效價達到標準。
　　2.瓊脂糖凝膠電泳顯示小鼠RNA提取質量、輕鏈和重鏈基因擴增及酶切結果符合要求。
　　3.輕鏈子庫測定庫容為3.6×106pfu，測序分析顯示其抗體基因正確

28、插入率為86％(6/7)。
　　4.Fab抗體庫測定庫容為4.4×107pfu，測序分析顯示其抗體基因正確插入率為80％(16/20)?？贵w重鏈序列分析顯示其均為鼠源性抗體序列，Germline亞型分析顯示其70％(7/10)分布在IGHV1家族，表明抗體基因完整性與文庫多態(tài)性均應大于80％。
　　5.經噬菌體展示抗體庫營救、噬菌體海選、ELISA初篩及確認，選擇一株單克隆菌液裂解上清與A*24∶191表達蛋白進行免疫印跡法