miRNA-181a在PDGF-BB誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移中的機(jī)制研究.pdf

1、隨著生活水平提高，動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)、心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)等血管增殖性疾病的發(fā)病率逐年升高，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的一大殺手，其中血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的異常增殖和遷移以及新生內(nèi)膜形成是此類疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。因此，探究VSMCs增殖遷移的發(fā)生機(jī)制對于闡明血管增殖性疾病的發(fā)病機(jī)理具有重

2、要意義。
　　血小板衍生因子(Platelet derived growth factor, PDGF)是1974年Ross等學(xué)者發(fā)現(xiàn)的一種來源于血小板且可促進(jìn)細(xì)胞增殖的生長因子，主要有PDGF-AA、PDGF-BB及PDGF-AB三種形式，其中PDGF-BB可與VSMCs表面的PDGF-β受體結(jié)合以激活多條信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和遷移。microRNA（miRNA）是一類發(fā)現(xiàn)于真核細(xì)胞中長約20~25個核苷酸的內(nèi)源性RNA分子，其

3、可參與多種生物學(xué)功能，是近幾年研究比較成熟的一類非編碼RNA，其主要通過堿基互補(bǔ)配對方式結(jié)合靶mRNA，導(dǎo)致靶mRNA降解或者阻遏翻譯，近幾年有一些關(guān)于miRNA通過靶基因調(diào)控VSMCs增殖遷移的文獻(xiàn)報道。研究證實(shí)miR-181a可參與腫瘤發(fā)生及炎癥等過程，且已確定了一些靶基因。我們利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)PDGFRA、14-3-3γ(YWHAG)、S1PR1及CREBL2等與細(xì)胞增殖遷移相關(guān)的基因可能為miR-181a新的靶基因，進(jìn)

4、一步分析發(fā)現(xiàn)miR-181a的表達(dá)與PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖呈負(fù)相關(guān)，提示miR-181a可能參與了PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖調(diào)控過程。因此，本課題擬探究miR-181a調(diào)控PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs增殖遷移過程及具體的分子機(jī)制。
　　本課題首先以人主動脈VSMCs為研究對象，利用MTT法及實(shí)時熒光定量RT-PCR法（quantificational real-time polymerase chain rea

5、ction, qRT-PCR）檢測不同濃度PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs后細(xì)胞增殖及miR-181a兩種成熟體miR-181a-3p和miR-181a-5p的表達(dá)；以慢病毒為載體過表達(dá)或抑制miR-181a并構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)VSMCs細(xì)胞系，探究miR-181a對PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs增殖及遷移的影響；利用生物信息學(xué)及雙熒光素酶報告基因法預(yù)測并驗(yàn)證miR-181a靶基因；構(gòu)建大鼠頸動脈球囊損傷模型，過表達(dá)或抑制miR-181a慢病毒局部感染

6、以探究miR-181a對新生內(nèi)膜形成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.不同濃度PDGF-BB（0、1、5、10、20 ng/mL）誘導(dǎo)VSMCs后，細(xì)胞增殖隨PDGF-BB升高而逐漸增強(qiáng)；miR-181a-3p及miR-181a-5p表達(dá)隨PDGF-BB濃度升高而逐漸下降，表明miR-181a可參與VSMCs增殖調(diào)控過程；miR-181a-3p占miR-181a-5p表達(dá)量約5~10％，表明主要為miR-181a-5p成熟體形式存在

7、并發(fā)揮作用。
　　2.利用慢病毒載體，感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection, MOI）為100感染人主動脈VSMCs，2μg/mL嘌呤霉素篩選后建立陰性對照（NC）、miR-181a-1 up（LV-miR-181a）和miR-181a-5p-inhibition（Anti-miR-181a-5p）穩(wěn)轉(zhuǎn)VSMCs細(xì)胞系；與NC組VSMCs相比， LV-miR-181a中miR-181a-5p表達(dá)上調(diào)約12倍

8、，說明穩(wěn)轉(zhuǎn)VSMCs細(xì)胞系構(gòu)建成功。MTT法、EdU法分析過表達(dá)miR-181a-1可顯著抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖，抑制miR-181a-5p可顯著促進(jìn)VSMCs增殖；增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA）蛋白水平測定呈現(xiàn)相同趨勢。細(xì)胞劃痕損傷法、Transwell小室法檢測過表達(dá)miR-181a-1可顯著抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs遷移，而抑制miR-18

9、1a-5p可促進(jìn)VSMCs的遷移。表明miR-181a-5p可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移。
　　3.利用Targetscan等生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-181a-5p與細(xì)胞增殖遷移相關(guān)的潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)PDGFRA、14-3-3γ、S1PR1及CREBL2可能為miR-181a-5p靶向調(diào)控的基因；構(gòu)建熒光素酶-靶基因3’-UTR及突變體真核表達(dá)載體，與miR-181a-5p mimics/inhibitors共

10、轉(zhuǎn)293細(xì)胞后檢測熒光素酶活性，14-3-3γ及S1PR1報告基因質(zhì)粒熒光素酶活性均顯著降低，表明14-3-3γ及S1PR1為 miR-181a-5p的靶基因。Western Blotting分析不同濃度PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs細(xì)胞14-3-3γ及S1PR1蛋白水平，結(jié)果顯示在一定濃度范圍內(nèi)兩種蛋白表達(dá)隨PDGF-BB濃度增加而增多，過表達(dá)miR-181a-5p VSMCs可顯著降低14-3-3γ及S1PR1蛋白水平。
　　4

11、.球囊拉傷法建立Sprague Dawley（SD）雄性大鼠頸動脈新生內(nèi)膜形成模型，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)（Sham）組相比，模型（Model）組大鼠頸總動脈組織中miR-181a-5p表達(dá)量下調(diào)約80%，暗示 miR-181a-5p參與新生內(nèi)膜形成過程；頸動脈局部感染LV-miR-181a慢病毒后miR-181a-5p表達(dá)量上調(diào)約4.5倍，病理形態(tài)學(xué)觀察過表達(dá)miR-181a后內(nèi)膜/中膜面積比值(I/M)相比NC組下降約40%

12、，而抑制miR-181a-5p后I/M升高約30%，表明miR-181a-5p可抑制新生內(nèi)膜形成；Western Blotting檢測Model組中14-3-3γ蛋白表達(dá)相比Sham組上調(diào)約4.5倍，過表達(dá)miR-181a后14-3-3γ蛋白表達(dá)量下調(diào)約35%。
　　上述結(jié)果表明，miR-181a-5p通過靶向14-3-3γ基因抑制PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs的增殖遷移和頸動脈損傷新生內(nèi)膜的形成，對于闡明血管增殖性疾病的發(fā)病機(jī)理具