基于生物質譜的糖蛋白質組學新技術新方法研究.pdf

1、本論文研究內容涉及化學學科的分析化學、化學生物學,是屬于交叉學科的研究。研究主要通過對糖基化相關分離富集技術、生物質譜技術和生物信息學等技術方法的運用和創(chuàng)新,以準確、高效的揭示重要樣本的糖基化修飾,包括糖基化位點和糖鏈信息。
　　鑒于蛋白質糖基化翻譯后修飾的重要性,糖蛋白質組學成為后蛋白質組學研究的熱門領域。近些年來,隨著與糖基化相關的分離富集技術、生物質譜技術等的發(fā)展和進步,越來越多具有重要意義的生物樣本中的糖基化修飾現(xiàn)象被揭示

2、和深入研究。盡管如此,現(xiàn)階段,在與糖基化研究相關的很多方面,方法學上的探索和發(fā)展還在不斷繼續(xù)。例如,分離富集技術還處于不斷優(yōu)化、完善,甚至發(fā)掘更優(yōu)途徑的階段;另外,生物質譜技術也正被全方面挖掘可以傳達出來的信息,以用于糖基化的解析。日益增加的糖基化研究相關數據的產出,以及人工解析糖基化的難度,也催生了生物信息學手段被不斷開發(fā)、應用到這一領域,以實現(xiàn)準確的、高通量的數據解讀,為更深入的糖基化研究提供支持。盡管如此,由于糖基化修飾的復雜性,

3、使這一領域還有很多的機遇和挑戰(zhàn),仍然有很多亟待探索的重要的生物樣本,完整糖肽的分析仍處于起步階段等。本論文工作主要基于生物質譜技術的優(yōu)勢,聯(lián)合并改善糖基化相關的分離富集技術,致力于為糖蛋白質組學領域提供重要、獨特的數據,以及建立具高效性和實用性的糖基化解析平臺。本論文工作的主要貢獻是:
　　(1)首次揭示了正常人肝的N-糖基化修飾譜,獲得了迄今最大的正常人肝N-糖基化蛋白/位點的數據集,是相關后續(xù)研究的重要參考和生物信息學解讀的數

4、據基礎:研究共獲得了915個N-糖蛋白及其包含的1,786個糖基化位點信息:是正常人肝蛋白表達譜的有利補充,提供了382個新增蛋白;基于該數據集,通過生物信息學解讀獲得了豐富信息。
　　(2)建立了處于國際領先水平的、高通量的完整糖基化肽段解析平臺(GRIP):應用精簡的、基于實驗的糖肽庫而非巨大的糖肽理論庫作為軟件檢索的基礎,通過嚴格的質量控制,在實際樣品鑒定中獲得出色的效果;目前己實現(xiàn)血清樣本中上千條N-糖肽的解析,并充分揭示

5、了糖基化的微觀不均一性,不但在高通量完整糖肽的研究領域處于前沿地位,而且有望成為血清糖基化檢測的有力工具。
　　(3)新穎的將串聯(lián)多酶切技術與糖基化富集技術聯(lián)合,建立了改善傳統(tǒng)糖基化實驗路線不足的新策略:策略之一,可改善高特異性富集下僅依賴去糖基化肽段實現(xiàn)蛋白、位點的鑒定,而使糖蛋白序列覆蓋度較低的問題,以及增加糖基化位點鑒定的可靠度;策略之二,有別于傳統(tǒng)完整糖肽分析中糖蛋白/位點鑒定與糖肽解析分流程進行的路線,可僅使用一個流程、

6、一步到位的實現(xiàn)蛋白鑒定和糖肽解析。
　　(4)首次將幾種基于B-消除反應原理的O-糖基化研究方法比較、應用于實際樣本血清:不但獲得了初具規(guī)模的O-糖基化數據集,而且方法間表現(xiàn)出的低互補性等重要特征,為相關方法學的應用和發(fā)展提共了有利的參考和指導。
　　論文一共分為以下四章進行闡述:
　　第一章緒論:闡述糖基化蛋白的重要性,并介紹糖蛋白質組研究相關領域的發(fā)展現(xiàn)狀。
　　作為最主要和普遍的蛋白質翻譯后修飾之一,糖基化

7、的作用涉及生理、病理等眾多方面。糖蛋白數量變化或糖鏈結構的改變,都可能導致疾病發(fā)生。不但目前已知的很多疾病的診斷標志物是糖蛋白,而且通過國際標準認證的藥物中,糖蛋白也占到較高的比例。糖蛋白主要有四類(N-連接、O-連接、GPI錨定和C-連接),研究最多的是其中的N-連接糖基化和O-連接糖基化,這也是我們目前研究工作主要關注的類型。糖基化的研究雖然至今仍是個難題,但在各種技術發(fā)展的推動下已有長足進步。例如,糖基化分離富集技術一定程度上改善

8、了高豐度非糖基化蛋白/肽段對糖基化目標物的掩蓋和抑制;各種特異性或非特異性的蛋白水解酶、糖苷水解酶的運用使對于糖基化位點、糖鏈的研究更為便利;生物質譜技術的發(fā)展使糖基化研究的規(guī)?；遮叧尚偷鹊?。即便如此,由于糖基化的復雜性,各種技術的發(fā)展和優(yōu)化仍是該領域的重點和熱點。同時,大量糖基化數據,特別是大量質譜數據的產出,也催生了相關的生物信息學分析工具的發(fā)展。各種工具,不論是針對純糖鏈分析的,還是可用于糖肽分析的,盡管一定程度上解決了人工分析

9、遇到的問題,但是仍然有很大局限性,例如對樣本純度、規(guī)模等的要求都十分有限?？傮w來講,蛋白糖基化修飾的研究還處于發(fā)展階段,充滿機遇和挑戰(zhàn)。
　　第二章：高通量N-糖基化位點研究:分為兩個章節(jié)(1)正常人肝蛋白質N-糖基化位點譜研究,以及(2)串聯(lián)雙酶解、高特異性N-糖基化富集鑒定新策略。
　　(1)作為人體最大的器官和主要的代謝器官,肝臟的功能及相關疾病的研究一直都備受關注。至2010年,中國人肝蛋白質組計劃(CNHLPP)己

10、獲得了六千多個蛋白的表達信息。然而,由于生物樣本的復雜程度高、蛋白豐度分布廣,所以時至今日如何擴大蛋白鑒定規(guī)模仍然是研究人員致力于解決的一個問題。將針對糖基化后修飾的分離富集作為一種降低樣本復雜程度的方式,不但可以針對性的獲得糖基化蛋白的相關信息,也有利于表達譜蛋白更全面的檢測。我們的工作聯(lián)合了不同分離富集技術(肼腙反應法、親水相互作用法)和串級質譜碎裂技術(碰撞誘導解離、電子轉移解離),獲得了大規(guī)模的正常人肝N-糖基化蛋白/位點數據集

11、:915個N-糖蛋白及其包含的l,786個糖基化位點;382個蛋白是原正常人肝蛋白表達譜中未鑒定到的,其中更有120個蛋白為肝臟組織特異性表達的。通過大量生物信息學分析,該數據集提供/體現(xiàn)出糖基化在正常人肝中的重要規(guī)律和特征,是后續(xù)深入研究重要的數據基礎。
　　(2)高通量的糖基化位點鑒定,特別是N-糖基化位點鑒定,也已在分離富集技術以及糖苷內切酶(如PNGaseF)的幫助下成為常規(guī)流程。然而,由于高特異性的富集(例如迄今最為穩(wěn)定

12、表現(xiàn)出高特異性的肼腙化學反應法),使獲得鑒定的糖蛋白序列覆蓋度偏低,有的甚至只有一條肽段覆蓋;另外,僅基于PNGaseF酶切產生的糖基化位點Asn分子量變化(+0.98Da)作為糖基化發(fā)生的證據也有不盡人意之處,例如該分子量變化較小、Asn可能發(fā)生自然水解等產生的假陽性。為了改善這些問題,我們統(tǒng)計并根據人類蛋白數據庫中的各種氨基酸分布頻率,以及蛋白酶的不同水解特異性,將兩種蛋白水解酶Lys-C和trypsin串聯(lián)使用,新穎的引入肼腙反應

13、法對糖肽的富集和鑒定中。該策略在通過標準蛋白的測試后,成功用于實際樣本細胞全蛋白裂解液。結果表明,在未犧牲富集方法高特異性的情況下,糖蛋白鑒定的序列覆蓋度平均增加了79.4％,約1/3的蛋白序列覆蓋度增加了一倍以上,有的增幅甚至高達350％。
　　第三章：高通量N-糖基化肽段研究:分為兩個章節(jié)(1)一步到位(one-pipeline)糖蛋白鑒定糖肽解析新策略,以及(2)高通量血清糖肽鑒定平臺(GRIP)的建立。
　　(1)糖

14、肽的解析,往往依賴于前期的分離富集。然而傳統(tǒng)方式上,在經過肽段水平的富集后,糖蛋白的鑒定和糖肽分析需要分為兩個流程進行:一個流程進行去糖基化處理,以實現(xiàn)蛋白的質譜鑒定(因為糖基化后修飾狀態(tài)目前無法實現(xiàn)數據庫檢索鑒定);另一個流程保留糖鏈完整進行結構分析。我們認為這些目的通過一個流程即可達到,而且能獲得附加信息。根據人類蛋白數據庫中的各種氨基酸分布頻率統(tǒng)計,以及蛋白酶的不同水解特異性,我們將兩次酶解(Lys-C和trypsin酶解)與兩個

15、水平上的糖基化富集(蛋白水平和肽段水平)進行了穿插聯(lián)合,使即使進行了肽段水平上的富集,最終用于質譜分析的混合物中既保留了完整糖肽,又包含了存在和數量都合理的非糖肽可用于蛋白鑒定,一舉兩得。該策略在通過標準蛋白的測試后,成功用于經一維凝膠電泳分離的血清樣本條帶中,結果通過55條非糖肽鑒定到23個糖基化蛋白,同時解析出25條的完整糖肽,其中包括2條O-糖肽(均為非冗余統(tǒng)計)。該策略不但實現(xiàn)了目前來講數目可觀的復雜樣本的糖肽解析,而且末端唾液

16、酸化、核心巖藻糖化、bisecting乙酰葡糖胺化等重要的糖鏈特征結構信息均被保留和揭示;糖基化微觀不均一性也被準確揭示。
　　(2)高通量的完整糖肽解析是目前糖基化研究中亟待攻克的一個難題。由于糖基化的復雜性高、存在豐度低等問題,以及糖肽異于一般肽段的特殊的物化性質,使高通量質譜分析或者獲得的數據復雜性大,或者無法通過單一的方式取得足夠信息;另外,目前仍沒有一種針對完整糖肽的富集方法,能高效的去除非糖肽的影響。這都對糖肽的解析造

17、成難度。目前瞄準糖肽解析的應用程序已有開發(fā),但是絕大多數或者對樣本復雜性的耐受度很低,或者給出使用者難以決斷的眾多結果,能被用戶方便、規(guī)模化使用的平臺十分欠缺。GRIP是我們建立的糖肽解析平臺GlycopeptideRevealingandInterpretationPlatform的簡稱,該平臺軟件的檢索基于實驗產生的、來自目標樣本的肽段庫和糖鏈庫生成的糖肽庫,而非巨大的理論糖肽庫;這使得該糖肽庫不但適于具體樣本,可隨樣本而變,而且減

18、少了理論庫檢索的假陽性。另外,我們充分利用糖肽在質譜中的碎裂特征,將這些特征作為譜圖篩選及假陽性控制的重要手段,準確的從海量譜圖中篩選出糖肽譜圖并進行解析。該研究目前己實現(xiàn)血清樣本中上千條非冗余糖肽的解析,結果中展示了蛋白糖基化微觀不均一性等重要信息,不但在國際上處于領先水平,也具有很好的實際應用前景。
　　第四章：基于B-消除反應的O-糖基化研究:比較和使用了現(xiàn)有的幾種beta-消除反應在實際樣品中的應用效果,為相關技術的實際應

19、用和發(fā)展研究提供了有利的參考和指導。
　　雖然分離富集方法以及廣譜性糖苷內切酶的使用,使得N-糖基化位點的鑒定常規(guī)化,但對于O-糖基化的研究,由于其核心結構眾多,且沒有廣譜性的糖苷水解酶,因而常規(guī)化、規(guī)模化的O-糖基化位點鑒定至今仍是個難題。多數以實現(xiàn)該目標為目的的研究多采用基于B-消除/加成反應的策略:消除反應實現(xiàn)去糖基化,Ser/Thr側鏈形成不飽和鍵;加成反應為原糖基化位點帶上利于后續(xù)分析、處理的質量或富集標簽。盡管有研究對

20、這類方法進行了改善和使用,但范圍往往限于標準肽段等簡單樣本。我們首次平行、比較使用了DTT加成法、氨水法、甲胺法等三種處理方法,不但考察了它們對同樣發(fā)生在Ser/Thr氨基酸上的磷酸化后修飾的影響,更將其應用到實際血清樣本中,獲得了來自96個蛋白的157個O-糖基化位點,但其中只有4個位點為一種以上方法共同鑒定。我們對這些位點進行分析還發(fā)現(xiàn)修飾發(fā)生在Ser氨基酸的比例高于Thr氨基酸(61％vs39％);同一蛋白中的糖基化位點常出現(xiàn)在鄰