抗多重耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株SC-2的物質基礎研究.pdf

1、多重耐藥性金黃色葡萄球菌（Methicillin—resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是一種遍布全球的高致死病原菌，被稱為“超級細菌”，目前MRSA感染已經(jīng)超過艾滋?。℉IV）、結核病和病毒性肝炎成為患者首位致死原因，嚴重威脅公共衛(wèi)生安全。MRSA對常見抗菌藥物耐藥現(xiàn)象嚴重，臨床使用的首選藥物萬古霉素也已分離出耐藥菌株，給臨床用藥帶來了巨大的困難。尋求能夠有效替代萬古霉素的抗MRSA先導化合物，開發(fā)

2、治療MRSA感染的新型抗菌藥物具有重大意義。
　　本課題以MRSA為指示菌篩選出一株高產生物活性物質的芽孢桿菌，在對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化化后，系統(tǒng)研究了發(fā)酵液中抗MRSA有效成分的分離方法、結構鑒定、體外活性評價及其含量測定。獲得如下成果：
　　1.從45株芽孢桿菌中篩選出一株對MRSA具有較強抑制作用且穩(wěn)定性好的菌株SC-2，通過對其形態(tài)觀察、生理生化特征及16S rDNA序列的測定，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillu

3、s subtilis）。
　　2.優(yōu)化出菌株SC-2的發(fā)酵培養(yǎng)基：C6H12O62.0％、黃豆粉0.5%、CaCO30.05%,pH7.0；菌株SC-2產抗MRSA活性物質的種子液培養(yǎng)條件:溫度36℃、接種量5%（V/V）、裝液量1000mL/2000mL瓶、時間16h；50L發(fā)酵罐參數(shù):溫度36℃、接種量5%（V/V）、轉數(shù)150r/min，通氣量1.5m3/h，罐壓0.05MPa，裝液量25L;700L發(fā)酵工藝:溫度36℃、接

4、種量7%（V/V）、轉數(shù)150r/min，通氣量21m3/h，罐壓0.05MPa,裝液量350L。
　　3.菌株SC-2發(fā)酵液抗MRSA活性提取物的制備工藝：采用納濾膜濃縮初步確定了SC-2發(fā)酵液中主要活性成分的分子量（200-1000）；篩選出HP20大孔吸附樹脂對SC-2膜濃縮液進行脫色，參數(shù)為：上樣量7BV,吸附流速2BV/h,再生溶劑為50%乙醇鹽酸溶液（2%HCI）；篩選出AmberliteXAD16N大孔吸附樹脂提取菌

5、株SC-2所產活性物質的工藝參數(shù)：吸附量3.5BV，吸附流速為1BV/h,洗脫溶劑為20%乙醇溶液，洗脫體積3.5BV，洗脫流速1BV/h；最后用75%乙醇沉淀去除雜質。整個工藝簡單，去雜率達到80%，最終粗提物的抗菌活性與同濃度的萬古霉素相當。
　　4.采用硅膠柱層析梯度洗脫收集活性組分，然后經(jīng)過Sephadex G-10過濾，最終利用HPLC制備得到一肽類抗MRSA活性成分G2-Ⅱ，純度大于95%?；衔颎2-Ⅱ通過質譜、氨基

6、酸N端測序、氨基酸組成分析，并與相關文獻報道產物比較，初步確定該化合物是由Ala-Lys-APPA組成的分子量為376.3的三肽化合物，分子式為C14H25N4O6P。
　　5.建立了HPLC法測定發(fā)酵液中活性化合物G2-Ⅱ含量的方法，色譜條件：Welchrom LP-C18(250mm×4.6mm，5um)，流動相甲醇-水（1:99→3:97，0-30min），流速0.8mL/min，檢測波長204nm，進樣量10uL，柱溫為2

7、5℃。結果顯示，化合物G2-II在5.0μg～25.0μg范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=2E+06x+870660，r=0.9996；采用該方法測定出菌株SC-2發(fā)酵液中活性化合物G2-II的含量約為0.90～0.93mg/L。
　　6.化合物G2-Ⅱ對耐藥金黃色葡萄球菌、耐藥鮑曼不動桿菌、痤瘡丙酸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌、白色念珠菌、馬拉色菌等常見致病菌都具有良好的拮抗作用，其抗菌譜較廣。G2-II對MRSA的M