周期性牽張應變對小鼠BMSCs早期向軟骨細胞分化的影響.pdf

1、目的：
　　觀察在平面誘導培養(yǎng)條件下,周期性等軸牽張應變刺激對小鼠BMSCs成軟骨分化早期的影響，探討周期性等軸牽張應變刺激在干細胞成軟骨分化過程早期的機制。
　　方法：
　　提取并分離昆明小鼠骨髓間充質干細胞后，換液、傳代培養(yǎng)至第3代，然后進行細胞表型鑒定及三系分化誘導。以2×105/孔的細胞量種植于BioFlex生物培養(yǎng)板。按不同處理因素將實驗分為2組：A組（非誘導組）：普通培養(yǎng)液培養(yǎng)8天，并分別給與0、1、3、5

2、、7天的力學加載；B組（誘導組）：使用成軟骨誘導液培養(yǎng)8天，并分別給與0、1、3、5、7天的力學加載。實驗采用美國Flexcell-5000力學加載系統(tǒng)，設置參數(shù)為正弦波0~1％Elong、1Hz、4h/D進行牽張刺激，并于2、4、6、8天換液。于培養(yǎng)第8日提取各組細胞，用CCK-8法檢測各組的增殖率；通過RT-PCR分析SOX9、Col-Ⅱ及ROCK1的基因表達。Elisa法測定最后一日各組糖胺聚糖含量；番紅O染色及阿爾新蘭染色觀測各

3、組細胞周基質。
　　結果：
　　1.原代細胞培養(yǎng)24小時后可觀察到部分貼壁生長，形狀呈類圓形、多邊形，傳代后細胞呈魚群狀生長，形成細胞集落。通過流式細胞儀鑒定，細胞表面CD45、Sca-1表達率小于3%，CD11b, CD44表達率大于95%，表明所分離的細胞幾乎均為間充質干細胞，且均一性好。對細胞進行三系分化誘導后染色，證實細胞可以分化為骨、軟骨、脂肪細胞。
　　2.細胞增殖率檢測：隨加載時間延長，A、B兩組增值率均

4、逐漸升高，在加載0天，B組增殖率較A組明顯下降，然而隨加載時間延長，B組增值率逐漸接近A組。
　　3.RT-PCR檢測：相關因素處理8天后， B組中SOX9、Col-Ⅱ、ROCK1 mRNA相對表達量均較A組增高（P＜0.05）；在A組內，SOX9未見明顯變化（P＞0.05），Col-Ⅱ隨加載時間的延長，表達量逐漸增加，ROCK1隨著加載時間的延長，其表達量逐漸下降；在B組內隨著加載時間的增加，SOX9、Col-Ⅱ相對表達量隨加載

5、時間延長，均逐漸增加，而ROCK1相對表達量則逐漸下降。
　　4.通過對最后一次換掉的培養(yǎng)基做糖胺聚糖濃度的Elisa檢測，結果發(fā)現(xiàn)A組內有減少趨勢，但是無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；B組內糖胺多糖的分泌量逐漸增加；且B組糖胺聚糖分泌量均較A組均增加（P＜0.05）。
　　5.番紅O及阿爾新蘭染色顯示，A、B兩組均有成軟骨分化趨勢，形狀隨時間加載均逐漸變長，B組變化均較A組明顯；A、B組內PCM、Col-Ⅱ、GAG含量隨力學