GmSARK和AtSARK基因調(diào)控葉片衰老分子機制的研究.pdf

1、葉片衰老是受遺傳程序嚴格控制的、植物個體發(fā)育過程中的一個必經(jīng)階段，與其它發(fā)育過程一樣，是由特殊發(fā)育信號通過一定的信號傳導(dǎo)路徑來啟動和控制的。植物L(fēng)RR型類受體蛋白激酶(LRR-RLKs)已被證明參與多種生命活動，并在其中發(fā)揮著重要功能。
　　 我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，一個大豆的LRR-RLK，GmSARK，具有雙底物特異性，它可以在體外自磷酸化絲/蘇氨酸殘基和酪氨酸殘基；同時發(fā)現(xiàn)GmSARK參與大豆葉片衰老的調(diào)控，利用RNA干擾

2、技術(shù)敲減GmSARK表達可以明顯延緩轉(zhuǎn)基因大豆衰老，而利用CaMV35S啟動子驅(qū)動GmSARK組成型過表達則導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因大豆、番茄和擬南芥早衰致死；由于GmSARK-RNAi轉(zhuǎn)基因大豆的花發(fā)育異常，具有一個細彎的柱頭和不開放的花瓣而導(dǎo)致不育，所以不能使用上述兩種轉(zhuǎn)基因材料對GmSARK的功能進行具體分析。為了進一步研究GmSARK的功能及其參與衰老信號調(diào)控的分子機制，本文在以前研究的基礎(chǔ)上，以GVG系統(tǒng)可誘導(dǎo)型啟動子(誘導(dǎo)劑為地塞米松de

3、xamethasone，DEX)控制GmSARK表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥為實驗材料，對GmSARK所介導(dǎo)的葉片衰老尤其是幾種不同的植物激素在其中的調(diào)控作用進行了更為深入的分析。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，外源誘導(dǎo)GmSARK過表達可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗產(chǎn)生早衰、彎曲根表型；導(dǎo)致成熟轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片衰老加速、產(chǎn)生與組成型乙烯超響應(yīng)突變體類似花等表型；并導(dǎo)致一些衰老關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子AtNAP、NAC1、NAC2和WRKY6等的表達量上升。
　　

4、 在葉片衰老過程中，葉綠體結(jié)構(gòu)與功能的破壞和葉綠素含量的下降是該過程的標志性事件；通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，外源誘導(dǎo)GmSARK過表達可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠體結(jié)構(gòu)嚴重破壞，造成其內(nèi)部簡單、類囊體數(shù)目明顯減少并積累大量淀粉顆粒；利用啟動子-報告基因β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)系統(tǒng)，對三種葉綠體功能缺陷型突變體背景下GmSARK-GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥進行分析，發(fā)現(xiàn)葉綠體功能缺陷又反饋促進GmSARK-GUS的活性

5、，形成一個滾動環(huán)使葉片衰老進入不可逆轉(zhuǎn)的階段。
　　 利用基因芯片技術(shù)進行分析，發(fā)現(xiàn)在過表達GmSARK的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，有大量激素相關(guān)基因的表達發(fā)生變化，其中變化最明顯的是生長素和乙烯。我們研究了細胞分裂素、生長素和乙烯與GmSARK之間發(fā)揮作用的關(guān)系。
　　 外源施加細胞分裂素可以有效抑制GmSARK-GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥中GmSARK啟動子活性，外源施加生長素和乙烯前體ACC都可以促進GmSARK-GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥

6、中GmSARK啟動子活性；另外，外源誘導(dǎo)GmSARK過表達可以有效降低細胞分裂素合成和信號響應(yīng)相關(guān)基因的表達，可以促進生長素和乙烯的合成和響應(yīng)相關(guān)基因的表達。同時，過表達GmSARK導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥對外源生長素的敏感性增強；通過檢測人工合成的生長素響應(yīng)元件DR5的表達情況，發(fā)現(xiàn)過表達GmSARK不僅改變根中生長素的濃度，還改變了其分布情況。
　　 通過外源激素處理與藥物抑制劑結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)，雖然外源細胞分裂素能夠強烈抑制GmSAR

7、K啟動子的活性，但只能部分恢復(fù)由GmSARK過表達所造成的幼苗早衰表型，而外源施加生長素作用抑制劑PCIB和乙烯合成抑制劑AVG能夠有效恢復(fù)由GmSARK過表達造成的早衰表型；PCIB的衰老恢復(fù)作用可以被外源ACC所逆轉(zhuǎn)，而AVG的衰老恢復(fù)作用不能被外源IAA逆轉(zhuǎn)；同時，我們發(fā)現(xiàn)在生長素輸入載體突變體aux1-7和乙烯不敏感突變體ein2-1中過表達GmSARK不僅不能引起轉(zhuǎn)基因擬南芥早衰，還可以恢復(fù)由GmSARK過表達造成的花發(fā)育異常

8、。以上結(jié)果表明，生長素和乙烯直接參與GmSARK介導(dǎo)的葉片衰老信號，并在其中發(fā)揮十分重要的作用，尤其是生長素促進的乙烯合成增加和信號響應(yīng)增強是導(dǎo)致這個過程中衰老事件發(fā)生和衰老過程加速的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們據(jù)此提出GmSARK和GmSARK類基因參與葉片衰老調(diào)控的模型，并對細胞分裂素、生長素和乙烯三種激素在GmSARK所介導(dǎo)的葉片衰老過程中的協(xié)同作用進行了分析和討論。
　　 我們首次在擬南芥中分離鑒定了GmSARK的同功能基因AtSAR

9、K。實驗室同期生化實驗證明，AtSARK也是一個新的、定位在質(zhì)膜的、具有雙底物特異性的LRR-RLK。定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，無論是在擬南芥自然衰老還是由GmSARK過表達造成的早衰過程中，AtSARK的表達量都顯著上升。通過對AtSARK T-DNA插入突變體和過表達AtSARK轉(zhuǎn)基因擬南芥系統(tǒng)的表型分析發(fā)現(xiàn)，敲減AtSARK表達可以有效延緩葉片衰老，而外源誘導(dǎo)AtSARK過表達則可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥早衰并產(chǎn)生異常的、與過表達GmS

10、ARK類似的花；同時外源抑制劑處理實驗也表明生長素和乙烯直接參與由AtSARK介導(dǎo)的衰老信號通路。因此，我們認為由SARKs介導(dǎo)的衰老信號通路在高等植物中普遍存在。
　　 最后，我們又從擬南芥中分離和鑒定了一個參與葉片衰老負調(diào)控的蛋白磷酸酶編碼基因，我們將其命名為SSPP。定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，無論是在擬南芥自然衰老還是由SARKs過表達造成的早衰過程中，SSPP的表達都顯著下降。對組成型過表達SSPP的轉(zhuǎn)基因擬南芥進行表型

11、分析，發(fā)現(xiàn)其葉片葉綠素含量升高，具有晚花、晚衰、生活史延長等表型；令人興奮的是，組成型過表達SSPP可以有效逆轉(zhuǎn)由AtSARK過表達造成的轉(zhuǎn)基因擬南芥早衰。此外，我們還發(fā)現(xiàn)過表達SSPP可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗干旱能力和對高溫敏感性增強。
　　 綜上所述，本課題研究了大豆葉片衰老相關(guān)的LRR-RLK基因GmSARK及其在擬南芥中同功能基因AtSARK參與葉片衰老調(diào)控的分子機制，結(jié)合葉片衰老負調(diào)控因子、功能未知蛋白磷酸酶編碼基因S