miR-20a-b靶向沉默ABCA1對膽固醇逆轉(zhuǎn)運的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化性疾病嚴(yán)重危害人類健康。泡沫細(xì)胞的形成在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。所以，有效的阻止泡沫細(xì)胞，是防治動脈粥樣硬化有效手段。
　　動脈粥樣硬化的的嚴(yán)重程度和血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。HDL-C拮抗動脈粥樣硬化的主要機制在于參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(RCT)過程。RCT的定義是，HDL把外周組織中過剩的膽固醇，轉(zhuǎn)運到肝臟，經(jīng)過代謝后變?yōu)槟懼崤懦鲶w外的過程，能夠阻止生成泡沫細(xì)胞，是較為公認(rèn)

2、的，防止動脈粥樣硬化機制之一。在RCT過程中，細(xì)胞內(nèi)膽固醇、磷脂通過三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ABCA1）轉(zhuǎn)移給apoA-I，它是HDL前體，新生成HDL，開始RCT過程，所以在RCT和新生成HDL中， ABCA1起著起始和限速作用。如果可以調(diào)節(jié) ABCA1蛋白的表達(dá)，就可以調(diào)節(jié)RCT，可以調(diào)控動脈粥樣硬化。
　　MicroRNA（miRNA）是一類高度保守的，長度一般在22個核苷酸左右，單鏈形式存在的，非編碼的RNA。miRN

3、A與靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)（UTR）互補結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平直接降解靶基因mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯。一個靶基因能夠被多個miRNA與其3’UTR特異結(jié)合來調(diào)控。因此，miRNA作為一類非常重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，與體內(nèi)代謝、增殖等病理生理過程起著重要作用，了解其詳細(xì)的調(diào)控機制，對疾病的發(fā)生和防治非常有意義。最近國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多個miRNA可調(diào)控ABCA1。在巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞和動脈粥樣硬化動物模型中， miR-33、 miR-758

4、、miR-106b、miR-27和miR-19b等miRNA可與ABCA1靶向結(jié)合，起到調(diào)節(jié)ABCA1的作用和調(diào)控動脈粥樣硬化的作用，提示miRNA已成為動脈粥樣硬化防治的重要靶點。
　　有研究表明，人動脈粥樣硬化腹主動脈瘤組織與人正常血管組織比較，miR-20a明顯升高。臨床數(shù)據(jù)顯示，冠心病患者血清中miR-20a表達(dá)較正常健康人群降低。糖尿病患者血清miR-20b較正常健康者降低。提示miR-20a/b與動脈粥樣硬化、冠心病有

5、著密切的關(guān)系，但是miR-20a/b在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的具體機制尚未明了。我們利用生物信息學(xué)靶基因預(yù)測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，miR-20a/b序列高度保守，并且miR-20a/b可與ABCA1的3’UTR靶向結(jié)合，并且二者結(jié)合自由能較低，提示結(jié)合較穩(wěn)定。
　　ABCA1的3’UTR較長再結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，我們推測： miR-20a/b可能通過與ABCA1的3’UTR靶向結(jié)合，ABCA1的翻譯過程受到抑制，使ABCA1蛋白的表達(dá)減

6、少，RCT效率降低，促使發(fā)生動脈粥樣硬化；miR-20a/b是一個可以對ABCA1起抑制作用新的miRNA。
　　為驗證以上假說，我們擬采用以下方案進行：
　　1、采用熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治鰉iR-20a/b與ABCA13’UTR的直接結(jié)合作用；
　　2、過表達(dá)或沉默THP-1源性、RAW264.7源性泡沫細(xì)胞的miR-20a/b，觀察細(xì)胞ABCA1表達(dá)水平、膽固醇與膽固醇酯含量及膽固醇流出率，離體研究miR-20a

7、/b對RCT的影響；
　　3、過表達(dá)或沉默apoE基因敲除鼠miR-20a/b，觀察對ABCA1表達(dá)水平、在體RCT效率、HDL-C水平、動脈粥樣硬化斑塊面積的影響，在體研究miR-20a/b對動脈粥樣硬化的影響。
　　4、臨床研究，比較冠心病患者與正常非冠心病體檢者，miR-20a/b的表達(dá)情況。
　　第一部分生物信息學(xué)預(yù)測和實驗驗證miR-20a/b與ABCA1靶向結(jié)合
　　目的：
　　生物信息學(xué)預(yù)測和

8、細(xì)胞實驗驗證，miR-20a/b與ABCA1靶向結(jié)合的情況。
　　方法：
　　在線打開數(shù)據(jù)庫 miRNAbase，輸入miR-20a/b查詢其序列。ABCA1的3’UTR序列在GeneBank中輸入查詢獲得。利用生物信息學(xué)在線預(yù)測數(shù)據(jù)庫分析miR-20a/b與 ABCA13’UTR的結(jié)合位點及結(jié)合自由能情況。然后進行熒光素酶報告基因?qū)嶒?，首先PCR法擴增THP-1單核細(xì)胞 ABCA1的3’UTR，然后將野生型 ABCA13’

9、UTR或突變型ABCA13’UTR重組熒光素酶質(zhì)粒和miR-20a/b mimic共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，最后檢測熒光素酶的活性。
　　結(jié)果：
　　成功獲取miR-20a/b序列和ABCA1的3’UTR序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-20a/b序列高度保守， miR-20a/b的種子序列與ABCA1的3’UTR序列完全配對，并且預(yù)測二者結(jié)合的自由能低，所預(yù)測分?jǐn)?shù)很高。熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，與con miR組比較，miR-2

10、0a/b可降低野生型ABCA1的3’UTR共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性，而不影響突變型ABCA1的3’UTR共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性。
　　結(jié)論：
　　生物信息學(xué)預(yù)測和熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實 miR-20a/b可與 ABCA1的3’UTR靶向結(jié)合。
　　第二部分 miR-20a/b靶向沉默泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)對膽固醇流出的影響
　　目的：
　　離體研究 miR-20a/b對 THP-1源性泡沫細(xì)胞和 RAW264.

11、7源性泡沫細(xì)胞ABCA1 mRNA和蛋白表達(dá)，及巨噬細(xì)胞膽固醇流出率和細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響。
　　方法：
　　利用THP-1單核細(xì)胞經(jīng)PMA分化為巨噬細(xì)胞，或常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，然后給予ox-LDL誘導(dǎo)上述巨噬細(xì)胞為泡沫細(xì)胞。使用Lipo RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑將下述各組干預(yù)因素轉(zhuǎn)染至以上兩種泡沫細(xì)胞，分為以下7組：
　?。?）對照組：正常泡沫細(xì)胞組；
　?。?）mimic con組：40nM m

12、imic con培養(yǎng)24h。
　　（3）miR-20a mimic組：40nM miR-20a mimic培養(yǎng)24h。
　　（4）miR-20b mimic組：40nM miR-20b mimic培養(yǎng)24h。
　?。?）inhibitor con組：40nM inhibitor con培養(yǎng)24h。
　　（6）miR-20a inhibitor組：40nM miR-20a inhibitor培養(yǎng)24h。
　　

13、（7）miR-20b inhibitor組：40nM miR-20b inhibitor培養(yǎng)24h。
　　檢測ABCA1 mRNA和蛋白的表達(dá)，使用real-time PCR和western blot法；然后測定 THP-1和RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率，使用液體閃爍儀；高效液相色譜檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。
　　結(jié)果：
　　與對照組比較，miR-20a/b mimic組ABCA1的mRNA和蛋白的表達(dá)減少，mi

14、R-20a/b inhibitor組ABCA1的mRNA和蛋白的表達(dá)增加，而mimic control和inhibitor control組ABCA1的表達(dá)無明顯變化。與對照組比較，miR-20a/b mimic組THP-1源性和RAW264.7源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出率降低，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量增加，而miR-20a/b inhibitor組細(xì)胞膽固醇流出率增加，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量降低。
　　結(jié)論：
　　miR-20a/b抑制泡沫

15、細(xì)胞ABCA1的表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，增加細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，有利于泡沫細(xì)胞形成；miR-20a/b inhibitor可促進泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，抑制泡沫細(xì)胞形成。
　　第三部分 miR-20a/b對apoE-/-動脈粥樣硬化小鼠ABCA1的表達(dá)及動脈粥樣硬化的影響
　　目的：
　　在體研究miR-20a/b對apoE-/-動脈粥樣硬化小鼠ABCA1的表達(dá)，及動脈粥樣

16、硬化的影響。
　　方法：
　　給予雄性apoE-/-小鼠喂養(yǎng)高脂飲食（21％豬油+0.21%膽固醇）10周造動脈粥樣硬化模型，皮下注射化學(xué)修飾后miRNA或anti-miRNA，分為以下7組：
　?。?）PBS組：給予與miR-20a等體積的PBS；
　　（2）con miR組：給予10mg/kg的conrol miRNA；
　?。?） miR-20a組：給予10mg/kg的miR-20a agomir；<

17、br>　?。?） miR-20b組：給予10mg/kg的miR-20b agomir；
　?。?）con anti-miR組：給予10mg/kg的conrol anti-miRNA；
　?。?）anti-miR-20a組：給予10mg/kg的anti-miR-20a；
　?。?）anti-miR-20b組：給予10mg/kg的anti-miR-20a。
　　檢測小鼠肝臟ABCA1 mRNA和蛋白的表達(dá)，使用rea

18、l-time PCR和western blot法。腹腔注射3H-膽固醇RAW264.7巨噬細(xì)胞，48h后收集小鼠的血清、肝臟及48h糞便，用液體閃爍計數(shù)測定 RAW264.7巨噬細(xì)胞在體膽固醇逆轉(zhuǎn)運效率；酶氧化法檢測甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和總膽固醇等血脂水平；檢測小鼠主動脈動脈粥樣硬化病變程度，使用油紅O病理染色和HE病理染色。
　　結(jié)果：
　　miR-20a/b

19、抑制apoE-/-動脈粥樣硬化小鼠肝臟ABCA1的mRNA和蛋白的表達(dá)，降低小鼠血清、肝臟、糞便的3H-膽固醇含量，使HDL-C水平下降，LDL-C含量升高，最終使得主動脈動脈粥樣硬化程度加重；而anti-miR-20a/b上調(diào)apoE-/-動脈粥樣硬化小鼠肝臟ABCA1的mRNA和蛋白的表達(dá)，增加小鼠血清、肝臟、糞便的3H-膽固醇含量，增加小鼠HDL-C水平，降低LDL-C水平，減輕主動脈動脈粥樣硬化病變程度。
　　結(jié)論：

20、>　　miR-20a/b可通過靶向沉默ABCA1的表達(dá)，影響血脂水平，加重動脈粥樣硬化病變；Anti-miR-20a/b可促進ABCA1的表達(dá)，改善血脂水平，減輕動脈粥樣硬化病變，為動脈粥樣硬化的治療提供新的思路。
　　第四部分冠心病患者血清miR-20a/b的表達(dá)及意義
　　目的：
　　研究冠心病患者血清miR-33和miR-20a/b的表達(dá)情況，初步闡明miR-20a/b在冠心病患者中的臨床意義。
　　方法：

21、
　　收集山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心血管內(nèi)科冠脈造影證實的冠心病患者40例，所有患者無高血壓病、無糖尿病、LDL小于3.12 mmol/L為冠心病組；收集社區(qū)正常體檢人群，無高血壓病、無糖尿病、LDL小于3.12 mmol/L的正常體檢人群40例為對照組。采用生化試劑盒檢測相關(guān)生化指標(biāo)，用Real time PCR法檢測miR-33和miR-20a/b的表達(dá)。對miR-33和miR-20a/b與HDL，LDL進行相關(guān)性分析，后進行非條

22、件logistic回歸多因素分析miR-33和miR-20a/b是否為冠心病獨立危險因素。
　　結(jié)果：
　　與健康對照組比較，冠心病組吸煙比例和飲酒比例較對照組高，BMI高，而HDL-C低。冠心病組miR-33和miR-20a/b表達(dá)均降低。對miR-33和miR-20/b與HDL-C與LDL-C相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，對照組，miR-33和miR-20a/b與HDL-C成負(fù)相關(guān)，但miR-33無統(tǒng)計學(xué)意義，miR-20a/b有統(tǒng)計

23、學(xué)意義。對照組三個miRNA與LDL相關(guān)性均無統(tǒng)計學(xué)意義。冠心病組，miR-33、miR-20a/b與HDL成正相關(guān)，miR-20a與miR-33有統(tǒng)計學(xué)意義，miR-20b無統(tǒng)計學(xué)意義。冠心病組僅miR-20a與LDL成負(fù)相關(guān)，有統(tǒng)計學(xué)意義。多因素分析發(fā)現(xiàn)，BMI，吸煙，miR-33和miR-20a是冠心病的獨立影響因素，但吸煙和miR-33的OR95%可信區(qū)間包括了1。
　　結(jié)論：
　　冠心病患者miR-33和miR-2