FOXO3a與ROS的相互作用及對人胚胎干細胞中胚層與心肌定向分化的影響.pdf

1、背景：
　　近年來，我國心血管病的發(fā)病人數持續(xù)增加，心梗等缺血性心臟病引起的急、慢性心衰已經成為目前重要的死亡原因。由于成人的心肌細胞損傷后的再生能力低下，因此，目前臨床上對于缺血性心臟病的治療仍是以阻止疾病進展，保護殘存心肌功能為主。隨著干細胞研究的不斷深入和再生醫(yī)學領域的快速發(fā)展，可在體外定向誘導人多能干細胞分化為心肌細胞，這就使通過人為替代病損心肌、恢復心功能從而治療缺血性心臟病及心衰成為可能。但是，由于目前人多能干細胞心肌

2、定向誘導分化過程的調控機制尚未完全闡明，使體外誘導分化的效率與純度都遠未達到移植治療的要求。因此只有充分闡明心肌定向分化的調控機理，才能提高分化效率使其盡早用于臨床。
　　目的：
　?、庞^察人胚胎干細胞心肌定向誘導分化過程中細胞內活性氧及轉錄因子FOXO3a蛋白水平的動態(tài)變化。⑵改變心肌分化過程中細胞內活性氧水平，觀察ROS變化對人胚胎干細胞心肌定向分化進程和效率的影響。⑶觀察FOXO3a敲低對人胚胎干細胞及其在心肌定向分化

3、過程中細胞內活性氧水平的影響。⑷觀察FOXO3a敲低后人胚胎干細胞心肌定向分化過程中中胚層特異性標記基因表達的影響。
　　方法：
　?、偈褂肏2DCFDA探針和CellROX橘色探針檢測人胚胎干細胞心肌定向誘導分化過程中細胞內源性活性氧水平的變化。②通過蛋白免疫印跡技術檢測分化過程中FOXO3a蛋白水平。③分別使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）和丁硫氨酸-亞砜亞胺（BSO）降低和提高細胞內源性ROS的水平。④通過實時熒光

4、定量 PCR技術檢測分化過程細胞中胚層及心肌分化特異性標記基因的表達情況。⑤流式細胞術檢測心肌分化末期，各實驗組細胞中心肌特異性標記肌鈣蛋白 T（TroponinT）的陽性比例。
　　結果：
　?、湃伺咛ジ杉毎募《ㄏ蛘T導分化過程中，ROS水平在誘導初期迅速上升，至第2～4天達到峰值，之后下降但仍保持在較高水平。⑵人胚胎干細胞心肌定向誘導分化過程中，FOXO3a蛋白在誘導第4天開始升高第6-8天達到峰值，隨后下降但仍保持在較

5、高水平。⑶分別使用抗氧化劑NAC或強氧化劑BSO處理細胞，能有效降低或提高了心肌定向分化過程中細胞內的ROS水平。⑷抗氧化劑NAC處理組較未處理組人胚胎干細胞心肌定向分化末期 cTNT陽性細胞比率較低且細胞數量明顯減少；強氧化劑BSO處理組心肌定向誘導分化末期cTNT陽性細胞比率較未處理組高。⑸人胚胎干細胞心肌定向誘導分化過程中，NAC處理組較未處理組中胚層心肌特異性基因表達降低或者峰值延遲，BSO處理組較未處理組中胚層與生心中胚層特異

6、性基因表達升高或峰值提前。⑹FOXO3a抑制人胚胎干細胞的ROS水平較正常對照組升高，并且心肌分化過程中中胚層與生心中胚層特異性基因表達也明顯高于對照組。
　　結論：
　?、偃伺咛ジ杉毎募《ㄏ蛘T導分化過程中細胞內ROS水平變化明顯且與FOXO3a的表達水平變化一致，FOXO3a可能是心肌分化過程中內源性ROS水平的重要調節(jié)因子。②人胚胎干細胞心肌定向誘導分化早期，細胞內源性ROS水平的升高對于中胚層與生心中胚層分化至關重要