ZBTB8A多克隆抗體制備及其相關(guān)信息的初步研究.pdf

1、由于ZBTB家族成員主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過(guò)BTB結(jié)構(gòu)域和ZNF結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的蛋白與蛋白之間的互作及蛋白與特異性堿基序列的結(jié)合從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡和細(xì)胞周期等重要的生理功能。目前關(guān)于ZBTB8A功能研究的報(bào)道很少，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查閱人ZBTB8A相關(guān)信息設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，通過(guò)RT-PCR從胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS中克隆到人ZBTB8A基因，測(cè)序證實(shí)其為目的基因，構(gòu)建ZBTB8A全長(zhǎng)及其截短的不同重組質(zhì)

2、粒，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　 使用ZBTB8A全長(zhǎng)及其截短的GFP融合表達(dá)載體來(lái)探索其在亞細(xì)胞水平上的分布情況，亞細(xì)胞定位顯示:GFP呈全細(xì)胞分布;GFP-ZBTB8A融合蛋白位于細(xì)胞核且呈斑點(diǎn)狀分布;GFP-ZBTB8A-BTB融合蛋白顯示核周斑點(diǎn)狀分布，GFP-ZBTB8A-ZNF融合蛋白呈細(xì)胞核均勻分布。這些結(jié)果表明，ZBTB8A蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子存在于核內(nèi)，其中這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在斑點(diǎn)狀分布中均起著重要的作用，這可能與它們自身

3、結(jié)構(gòu)域的功能相關(guān)。
　　 為了探討ZBTB8A可能參與調(diào)控的細(xì)胞信號(hào)通路，采用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒來(lái)檢測(cè)ZBTB8A對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示:ZBTB8A蛋白抑制多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路活性，特別對(duì)pCRE-Luc具有顯著的抑制效應(yīng)并表現(xiàn)為劑量依賴(lài)性。這說(shuō)明ZBTB8A蛋白在某些功能方面可能作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，參與多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路活性的調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移和細(xì)胞周期等重要的生理過(guò)程。

4、>　　 將原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-ZBTB8A轉(zhuǎn)化到BL21宿主菌，當(dāng)菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，加入終濃度為0.6mMIPTG誘導(dǎo)5小時(shí)，將誘導(dǎo)的菌體裂解液經(jīng)SDS-PAGE電泳后，浸泡于0.25MKCl溶液，切下乳白色的目的條帶并切碎，電洗脫和透析，獲得GST-ZBTB8A融合蛋白，免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)所純化的蛋白為目的蛋白（抗GST標(biāo)簽抗體），BCA法測(cè)定其濃度為1.254mg/mL，用純化的蛋白多次免疫兔子，獲得相應(yīng)的免疫血清