中華卵索線蟲cDNA文庫構建及Sox-3基因部分片段的克隆.pdf

1、中華卵索線蟲(Ovomermis sinensis)屬于線蟲綱Nematouda毛管超目Trichosyfingida索目Mermithida索科Mermithidae六索線蟲亞科Hexamermithinae卵索線蟲屬Ovomermis，是一種昆蟲病原線蟲。該線蟲營寄生生活，寄主廣泛，寄生率幾乎等于害蟲的死亡率，具有很大生物防治潛力?，F階段人們常采用噴灑化學農藥的方法來防治農業(yè)害蟲，但同時也間接地殺害了田間的中華卵索線蟲，導致其數量銳

2、減并面臨滅絕的危險，且目前實現其大量體外培養(yǎng)的條件尚未成熟。本研究的目的在于通過構建中華卵索線蟲cDNA文庫來保存該物種基因資源，便于相關功能基因的篩選和研究。cDNA文庫是以特定組織或細胞的mRNA為模板，通過逆轉錄酶逆轉錄形成cDNA，經載體連接且轉化受體菌后形成重組DNA克隆群。所構成的文庫包含該組織或細胞的全部mRNA信息，反映其特定階段基因的表達情況。cDNA文庫較基因組文庫小，便于特異基因的篩選，自1976年首次成功構建cD

3、NA文庫以來，相繼出現標準化cDNA、染色體區(qū)域特異性cDNA文庫、消減cDNA文庫、酵母雙雜交cDNA文庫、SMART cDNA文庫等構建方法。隨著科學技術的發(fā)展，文庫構建的方法越來越簡便，文庫的質量也越來越高。
　　 本實驗使用Trizol試劑從各發(fā)育期中華卵索線蟲提取總RNA，以其作為反轉錄模板，通過Clontech公司購買的CreatorTM SMARTTM試劑盒構建cDNA文庫，與T載體連接后電轉大腸桿菌，涂布在含相應

4、抗生素的LB固體平板37℃過夜培養(yǎng)，第二天收集菌落，且滴度測定，實驗數據表明所構建的cDNA文庫滴度為1.16×109cfu/ml，包含克隆數為6.0×106，重組率接近100％。符合cDNA文庫構建標準，可用于后續(xù)基因的篩選和功能研究。
　　 Sox基因家族保守性較高，普遍表達于鳥類、魚類、爬行類等動物中，通過對其功能研究發(fā)現，該基因在性別決定與分化、神經系統的發(fā)育、早期胚胎的發(fā)育、軟骨和組織器官的形成中起重要作用。Sox基因