大腸桿菌DNA復(fù)制相關(guān)蛋白PriC的初步研究.pdf

1、大腸桿菌DNA復(fù)制是以半不連續(xù)方式進(jìn)行,滯后鏈的復(fù)制引發(fā)是由引發(fā)體(Primosome)參與完成的。大腸桿菌里,目前至少有兩種引發(fā)體已經(jīng)得到確認(rèn),分別是DnaA-dependent primosome和PriA-dependent primosome。PriA、PriB、PriC、DnaB、DnaC、:DnaT和DnaG共同參與了PriA-dependent primosome的組裝。
　　 目前,關(guān)于PriC的表達(dá)及其功能了解

2、的很少,為了研究其在引發(fā)體的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制,本課題在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)了PriC,經(jīng)Ni柱親和層析純化獲得的蛋白穩(wěn)定性較差,易沉淀。根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白穩(wěn)定性預(yù)測(cè)及限制性蛋白酶水解結(jié)果,構(gòu)建了PriC的截短突變蛋白PriC1-101,經(jīng)Ni親和層析和superdex75純化,獲得了穩(wěn)定性較好的蛋白,經(jīng)Western blot鑒定為目的蛋白。PriC1-101的圓二色譜分析發(fā)現(xiàn)其具有較多的α-helix和無(wú)規(guī)卷曲,這為更好的了解其結(jié)

3、構(gòu)奠定了重要的基礎(chǔ)。為了研究PriC與PriB是否存在相互作用,將pET21a-PriC-notag與pET28at-plus-PriB分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,誘導(dǎo)表達(dá)及共純化發(fā)現(xiàn)PriC與PriB存在相互作用,并且PriC的穩(wěn)定性有所提高。通過全長(zhǎng)PriC及PriC1-101分別與PriB的Pull down結(jié)果發(fā)現(xiàn),PriC蛋白的C-端氨基酸序列是PriC蛋白與PriB蛋白相互作用的主要區(qū)域,并對(duì)PriC蛋白的穩(wěn)定性