探究孕酮信號(hào)通路中HIF1對(duì)PPARγ和Edn2調(diào)控的分子機(jī)制.pdf

1、哺乳動(dòng)物排卵在雌性生殖活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，孕酮是開(kāi)啟排卵的關(guān)鍵因子，其主要通過(guò)孕酮受體（Progesterone receptor,PGR）產(chǎn)生生理作用，用PGR抑制劑或?qū)⑵錀l件性敲除后均降低卵母細(xì)胞的數(shù)目，甚至出現(xiàn)不育現(xiàn)象。此外，在該過(guò)程中，因脈管脫落和重塑而形成間斷的低氧環(huán)境，也能影響排卵事件的正常進(jìn)行。因此孕酮和低氧在排卵過(guò)程中至關(guān)重要。近年來(lái)通過(guò)大數(shù)據(jù)分析篩選出大量的PGR下游基因，但在已知的基因中卻很少發(fā)現(xiàn)孕酮響應(yīng)元件，如參與

2、排卵過(guò)程中卵泡破裂和炎癥反應(yīng)的Edn2、PPARγ。這兩個(gè)基因是否受PGR和低氧的調(diào)控，如何進(jìn)行調(diào)控，以及如何協(xié)調(diào)參與排卵過(guò)程等，這些問(wèn)題均有待闡明。
　　本實(shí)驗(yàn)以未性成熟的雌性昆明小鼠和人源KGN細(xì)胞為研究對(duì)象。1）用PMSG/hCG構(gòu)建小鼠超排卵模型，聯(lián)用PGR抑制劑RU486，收集小鼠卵泡中的顆粒細(xì)胞檢測(cè)Edn2和PPARγ的mRNA的表達(dá)情況；2）在此基礎(chǔ)上，輔以低氧模擬物CoCl2，探究低氧對(duì)顆粒細(xì)胞中Edn2和PPAR

3、γ的影響；3）進(jìn)一步地，在KGN中超表達(dá)PGR、HIF1，以探究PGR、HIF1對(duì)Edn2和PPARγ的影響；4）為確認(rèn)HIF1α的調(diào)控作用，采用CRISPR-Cas9技術(shù)在KGN細(xì)胞中構(gòu)建HIF1α特異性敲除細(xì)胞系，輔以CoCl2處理，研究HIF1α介導(dǎo)PGR調(diào)控Edn2和PPARγ的機(jī)制；5）利用生物信息學(xué)分析孕酮調(diào)節(jié)信號(hào)中的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1）PPARγ和Edn2在PMSG處理48h，hCG處理11h后表達(dá)量顯著性

4、增加，但經(jīng)RU486處理后表達(dá)量卻顯著下降；2）經(jīng)CoCl2處理12h后顯著提高Vegfa、PPARγ和Edn2的表達(dá)量；3）在KGN細(xì)胞中超表達(dá)HIF1各載體發(fā)現(xiàn)其主要通過(guò)HIF1α調(diào)控下游基因，且可通過(guò)低氧響應(yīng)元件調(diào)控Edn2；4）缺失HIF1α后Edn2和PPARγ的mRNA與蛋白本底水平在CoCl2刺激下均顯著下降；而且超表達(dá)PGR致Vegfa、Edn2和PPARγ的表達(dá)升高因HIF1α缺失后受阻；5）通過(guò)芯片數(shù)據(jù)分析探索并初步