小凹蛋白-1調節(jié)細胞外鈣敏感受體介導NO生成的作用機制.pdf

1、目的：1探討小凹蛋白-1(Cav-1)上調人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)鈣敏感受體(CaR)介導一氧化氮(NO)生成的作用機制。
　　方法：(1)胰蛋白酶消化法原代培養(yǎng)HUVEC，倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)學觀察及免疫細胞化學法測Ⅷ因子對其進行抗原鑒定。(2)取2～5代HUVEC隨機分組：不同濃度filipin處理組(1.5mg/L,2mg/L,2.5mg/L)，采用Westernblotting技術提取細胞總蛋白檢測Cav-1、e

2、NOS和p-eNOS蛋白的表達。(3)取2～5代細胞隨機分組：對照組(Ca2+-free/HBS)；CaR激動劑精胺(spermine,2mmol/L)+Ca2+組；Caveolae結構破壞劑(filipin,1.5mg/L)+spermine+Ca2+組；Cav-1ShRNA+spermine+Ca2+組；空質粒(Vehicle)+spermine+Ca2+組；Westernblotting技術檢測Cav-1、eNOS、p-eNOS總

3、蛋白和Cav-1、eNOS膜蛋白的表達；免疫熒光雙標技術檢測Cav-1和eNOS表達、共定位；免疫共沉淀(Co-IP)技術檢測Cav-1和eNOS相互作用。(4)實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤表示，組間比較用單因素方差分析，均數(shù)間的比較采用t檢驗或卡方檢驗。所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行分析，以p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：(1)細胞形態(tài)學與免疫細胞化學法測Ⅷ證實原代培養(yǎng)的細胞為HUVEC。(2)HUVEC經不

4、同濃度filipin(1.5mg/L、2mg/L和2.5mg/L)處理后Cav-1、eNOS和p-eNOS蛋白表達結果顯示：各加藥組與Control組相比，均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(3)總蛋白Westernblotting檢測結果顯示：與Control組相比，spermine+Ca2+組和Vehicle+spermine+Ca2+組中p-eNOS蛋白表達增加(P<0.05)；與Control組和spermine+Ca2+組相比，

5、filipin或Cav-1干擾處理后，p-eNOS蛋白表達減少(P<0.05)，Cav-1ShRNA組Cav-1蛋白表達亦減少(P<0.05)；各組eNOS蛋白表達均無差異(P>0.05)。(4)小凹(Caveolae)提取結果顯示：Cav-1和eNOS共定位于同一Caveolae區(qū)，filipin處理組Cav-1在Caveolae表達較對照組減少(P<0.05)。(5)膜蛋白提取結果如下：同Control組和spermine+Ca2+

6、組比較，filipin或Cav-1干擾處理后，Cav-1和eNOS膜蛋白表達均減少(P<0.05)。(6)免疫細胞化學技術檢測HUVEC中Cav-1與eNOS蛋白表達呈陽性，兩者共定位于膜上，經filipin處理后Cav-1和eNOS膜上定位減少，與eNOS在核周邊聚集明顯增多，Cav-1干擾后，eNOS亦較多聚集在核周邊。(7)Co-IP檢測結果如下：與Control組和spermine+Ca2+組比較，Cav-1ShRNA處理組Ca