提高重組桿狀病毒表達系統(tǒng)的表達量和特異性的研究.pdf

1、復旦大學碩士學位論文提高重組桿狀病毒表達系統(tǒng)的表達量和特異性的研究姓名：張靜申請學位級別：碩士專業(yè)：微生物學指導教師：鐘江20060527復旦大學碩士學位論文提高重組桿裝病毒的表達量和特異性的研究摘要重組昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)(recombinantbaculovirusexpressionsystem)在昆蟲細胞中由于具有表達量高，不易形成包涵體，有一定的轉錄后修飾等優(yōu)點，已經被廣泛應用于真核蛋白的表達。起初，人們以為桿狀病毒只能感染昆

2、蟲鱗翅目家族的成員，然而在1983年Volkman和Goldsmith首次發(fā)現(xiàn)了桿狀病毒也可以進入脊椎動物細胞。這一革命性的報道從此揭開了桿狀病毒作為哺乳動物細胞基因轉移載體的研究?，F(xiàn)在已有的文獻證明桿狀病毒可以感染多種哺乳動物細胞，尤其是對肝細胞具有較強的偏好性。其具體的進入途徑雖然還不是十分明了，不過研究顯示是和細胞非特異性的胞吞作用相關。桿狀病毒作為哺乳動物細胞基因轉移的載體有很多獨特的優(yōu)點。譬如：安全性好，不能復制傳代；對外源基

3、因的容量大，其核衣殼至少可以容納lOOkb的外源基因；毒副作用小，即使在高MOI感染時也不會引起細胞毒性。鑒于桿狀病毒對于肝細胞較高的感染率，一些試圖將桿狀病毒改造成肝細胞特異性基因表達載體的研究已有所報道。例如在重組桿狀病毒表達框中引入肝癌細胞特異性甲胎蛋白(AFP)的啟動子和增強子，以此將外源基因選擇性的導入肝癌細胞中。但是桿狀病毒作為真核細胞基因轉移的載體還有一些自身無法克服的缺點。如：在哺乳動物細胞中不能復制，引入的外源基因表達

4、量不高等問題。本試驗設計的目的就在于改造重組桿狀病毒表達載體，以期能提高外源基因的表達量。實驗選用了AFP增強子(enhancer)和HS4絕緣子(insulator)兩個調控元件，以及綠色熒光蛋白(GFP)報告基因來構建重組桿狀病毒。其中綠色熒光蛋白表達框為CMV和p10雙啟動子。雙啟動子便于在昆蟲細胞中篩選重組病毒。選用AFPenhancer一方面是為了維持其肝癌細胞特異性另一方面是為了提高GFP的表達。選用HS4insulator