一種新型流感病毒亞單位疫苗的表達、純化及其初步免疫學效應的研究.pdf

1、流感是一種流感病毒引起的嚴重性呼吸道疾病。流感病毒(Influenza vns，Iv)具有高度傳染性，能在短期內突然發(fā)生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界大流行，導致全球人力資源和物力資源的重大損失。流感病毒的主要表面抗原之一—血凝素(HA)，具有高度變異性，致使流感病毒疫苗一般每年都要更換，給疫苗的制備和生產造成了諸多不便。而流感病毒的跨膜蛋白一基質蛋白2(M2蛋白)，含有高度保守的抗原表位，是病毒亞型間交叉保護性疫苗的候選抗原

2、。流感病毒變異速度非常快，尤其是當前禽流感病毒逐漸蔓延到人群中，對人類危害越來越大，因此研制出一種新穎的具有廣泛保護作用的疫苗對于控制流感病毒流行具有極其重要的意義。 本研究選擇了A型流感病毒的缺失跨膜區(qū)M2以及H1N1和H3N2亞型流感病毒HA的7個保守的B細胞表位和T細胞表位。采用大腸桿菌偏愛的密碼子對M2外膜區(qū)基因和HA多表位基因進行了優(yōu)化設計。通過合成引物，利用重疊延伸PCR(OE-PCR)和搭橋式PCR方法分別擴增得到

3、A型流感病毒M2蛋白缺失跨膜區(qū)基因和HA多表位基因，依次克隆到表達載體中，構建重組質粒pET28a+-M2d-HA，經測序表明，插入表達載體中的外源基因的序列與理論設計的基因序列完全一致。 將重組表達質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，篩選獲得了高效表達重組融合蛋白的工程菌，表達重組蛋白約占菌體總蛋白總量的45％左右。表達產物以包涵體形式存在，經包涵體處理，親和層析純化后，重組蛋白稀釋復性，再經陰離子交換層析純化得到純度在90％

4、以上的目的蛋白。Westem blot結果顯示純化的重組蛋白具有較好的抗原性和特異性。重組蛋白免疫小鼠后，利用ELISA實驗檢測重組蛋白在小鼠體內獲得了很高的抗體免疫水平；利用免疫熒光實驗觀察，重組蛋白抗血清對MDCK細胞上的流感病毒能夠產生很好的抗原性。 本研究成功構建了流感病毒M2d-HA抗原多表位重組蛋白表達載體，在大腸桿菌中獲得了高效表達；通過基因工程獲取較高純度的M2d-HA重組蛋白，同時對蛋白表達、純化復性等實驗條件