鄂贛浙3省10地12株并殖吸蟲(chóng)基因ITS2分析.pdf

1、并殖吸蟲(chóng)俗稱(chēng)肺吸蟲(chóng)，某些寄生于人體的蟲(chóng)體可引起并殖吸蟲(chóng)病(肺吸蟲(chóng)病)。并殖吸蟲(chóng)在分類(lèi)上隸屬于生物的真核總界、動(dòng)物界、扁形動(dòng)物門(mén)、吸蟲(chóng)綱、復(fù)殖目、并殖科。并殖吸蟲(chóng)種類(lèi)命名甚多，存在同種異名和種名錯(cuò)定等諸多問(wèn)題。并殖吸蟲(chóng)在東亞、東南亞、非洲和拉丁美州等國(guó)家廣泛存在；中國(guó)各地也均有發(fā)現(xiàn)，主要在江南、西南與東北各地。從1879年Ringer首先在我國(guó)臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)人體病例130年以來(lái)，世界學(xué)者對(duì)并殖吸蟲(chóng)的特征、獨(dú)立地位、地理分布和致病作用等存在分歧。

2、主要以并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)形態(tài)和生活史為依據(jù)的傳統(tǒng)分類(lèi)存在一定的局限性，如因不同地區(qū)、不同宿主、不同發(fā)育期和標(biāo)本制作時(shí)個(gè)體差異所導(dǎo)致成蟲(chóng)的形態(tài)差異。而對(duì)于生活史，目前只有少數(shù)蟲(chóng)種的生活史被完整闡明，有一些蟲(chóng)種的第一和第二中間宿主尚未被證實(shí)。20世紀(jì)60～80年代，由于并殖吸蟲(chóng)分類(lèi)研究極度活躍，出現(xiàn)了很多并殖吸蟲(chóng)新種的描述。20世紀(jì)90年代以來(lái)，分子生物學(xué)的發(fā)展為研究物種遺傳變異奠定了基礎(chǔ)。
　　 目的：采用ITS2基因序列分析技術(shù)對(duì)鄂浙

3、贛3省10地12株并殖吸蟲(chóng)進(jìn)行遺傳變異檢測(cè)，以了解基因序列變化差異，為并殖吸蟲(chóng)分類(lèi)提供依據(jù)，同時(shí)也為湖北省并殖吸蟲(chóng)流行區(qū)的劃分提供可靠的分子生物學(xué)依據(jù)。
　　 方法：采集鄂贛浙3省10地：湖北省咸寧市溫泉區(qū)桂花鎮(zhèn)茅田、江西武寧縣三爪、浙江紹興蘭亭鄉(xiāng)、湖北省赤壁市趙李橋鎮(zhèn)柘砰村、湖北省十堰市花果、湖北省五峰縣、湖北鶴峰縣五里鎮(zhèn)南村、湖北鶴峰縣走馬鎮(zhèn)大典、湖北隨州和湖北神農(nóng)架林區(qū)等10地共12株并殖吸蟲(chóng)。其中湖北咸寧株、湖北十堰株、

4、江西武寧株和浙江蘭亭株為成蟲(chóng)，湖北隨州株為童蟲(chóng)，其余5地標(biāo)本均為囊蚴。為避免混淆，本文中均以地理株命名。12株并殖吸蟲(chóng)標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察測(cè)量，并提取4地成蟲(chóng)、1地童蟲(chóng)和5地囊蚴的基因組DNA。用3s’和BD2兩對(duì)引物擴(kuò)增ITS2序列，獲得基因片段交由上海生工公司進(jìn)行基因測(cè)序。所得12株并殖吸蟲(chóng)ITS 2序列經(jīng)Bioedit、Clustalx和MEGA4.0等軟件進(jìn)行遺傳距離分析，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。
　　 結(jié)果：⑴外形觀察：成蟲(chóng)

5、湖北十堰株呈長(zhǎng)梭形，湖北咸寧株、江西武寧株和浙江蘭亭株等3株呈橢圓形；囊蚴 5地囊蚴呈橢圓形或類(lèi)圓形，囊壁2層，排泄囊內(nèi)含黑色顆粒，經(jīng)鑒定為并殖吸蟲(chóng)囊蚴。其中湖北赤壁株內(nèi)壁較厚；五峰a、五峰b、走馬a、走馬b和五里等5株內(nèi)壁較?。缓鄙褶r(nóng)架株的囊蚴形態(tài)因故已有變形，但可以確定為并殖吸蟲(chóng)；童蟲(chóng) 湖北隨州株呈長(zhǎng)梭形。⑵DNA提?。篋NA溶液A260/280值經(jīng)測(cè)定在1.60～2.00之間，純度符合要求。⑶PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序，通過(guò)MEGA4

6、.0分析基因序列：各株間差異湖北咸寧株、江西武寧株、浙江蘭亭株和湖北赤壁株等4株的遺傳距離在0.01897～0.11278；湖北走馬a、b兩株，湖北五峰a、b兩株，湖北十堰株，湖北五里株和湖北隨州株等7株斯氏并殖吸蟲(chóng)在遺傳樹(shù)上呈現(xiàn)兩支，最后成一大支，其7株遺傳距離是0.00004～0.08401；湖北神農(nóng)架發(fā)現(xiàn)的并殖吸蟲(chóng)，該株在進(jìn)化樹(shù)上獨(dú)立成一支，與衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)遺傳距離在0.01897～0.11278，與斯氏并殖吸蟲(chóng)遺傳距離在0.013

7、55～0.12195；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)通過(guò)MEGA4.0軟件所構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中12株并殖吸蟲(chóng)分為三類(lèi)：江西武寧株、浙江蘭亭株、湖北咸寧株和湖北赤壁株等4株為衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)；湖北走馬a、b兩株，湖北五峰a、b兩株，湖北十堰，湖北五里和湖北隨州等7株為斯氏并殖吸蟲(chóng)；湖北神農(nóng)架株獨(dú)立成一類(lèi)，為尚不明確的一種并殖吸蟲(chóng)。⑷湖北省存在兩個(gè)并殖吸蟲(chóng)流行區(qū)：以衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)為主的鄂東南和以斯氏并殖吸蟲(chóng)為主的鄂西兩個(gè)并殖吸蟲(chóng)病流行區(qū)。
　　 結(jié)論：①根據(jù)基因

8、刪序分析的結(jié)果，3省10地12株并殖吸蟲(chóng)在基因水平上分為3類(lèi)：江西武寧株、浙江蘭亭株、湖北咸寧株和湖北赤壁株等4株為衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)；湖北走馬a、b兩株，湖北五峰a、b兩株，湖北十堰，湖北五里和湖北隨州等7株為斯氏并殖吸蟲(chóng)；湖北神農(nóng)架株獨(dú)立成一類(lèi)，為尚不明確的一種并殖吸蟲(chóng)。②湖北省存在以衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)為主的鄂東南和以斯氏為主的鄂西兩個(gè)并殖吸蟲(chóng)病流行區(qū)。③采用童蟲(chóng)、成蟲(chóng)和囊蚴等3個(gè)不同蟲(chóng)期標(biāo)本，尤其是本實(shí)驗(yàn)首次采用童蟲(chóng)樣本，對(duì)研究并殖吸蟲(chóng)遺傳變