轉錄因子ZmNAM056調控玉米淀粉合成相關基因表達的初探.pdf

1、玉米（Zea mayL.）是世界第一大糧食作物，種植面積和產量均居三大糧食作物之首，玉米淀粉也是各種植物淀粉中化學成分最佳的淀粉之一。如今，隨著世界人口的日益增加，資源及耕地面積的日益減少，對作物產量及品質的要求也就越來越高。
　　淀粉的生物合成過程的核心包括ADPG的合成，多糖鏈的延伸，多糖鏈的的分支，多糖鏈的去分支。淀粉的生物合成是一個十分復雜的過程，是在一系列酶的共同催化下完成的，在籽粒胚乳中淀粉合成的最后階段涉及四類非常關

2、鍵的酶類:腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase)、淀粉合成酶(Starch synthase，SS)、淀粉分支酶(Starch branching enzyme，SBE)和淀粉去分支酶(Starch debranching enzyme，DBE)。目前對于淀粉相關合成酶的功能研究做得相對成熟，但對于淀粉合成相關酶的上游調控機制研究，即淀粉合成相關酶的順式作用元件和反式作用因

3、子的研究報道較少。
　　我們根據文獻報道和現有基因資源選取在玉米胚乳中特異表達或高表達的參與淀粉合成關鍵酶編碼的8個基因:Sh2、Bt2、SSⅠ、SSⅡa、SSⅢa、sbe1、sbeⅡb、Isa1。課題組前期通過RNA-seq測定玉米籽粒灌漿時期不同關鍵點胚乳RNA表達譜，篩選了可能參與玉米胚乳淀粉合成的轉錄因子;同時利用公共數據庫通過共相關分析、篩選與上述8個淀粉合成相關基因表達相關的轉錄因子，取相關系數極高的轉錄因子列為候選轉

4、錄因子。我們比較通過這兩種方法篩選到的候選轉錄因子，發(fā)現了一個共同的NAC家族的轉錄因子，并命名為ZmNAM056。在此基礎之上采用半定量RT-PCR或熒光定量PCR、基因瞬時表達、酵母單雜交以及亞細胞定位繼續(xù)驗證篩選的轉錄因子對淀粉合成關鍵酶基因表達的調控作用，具體結果如下:
　　1、以玉米優(yōu)良骨干自交系B73為實驗材料，我們成功從玉米胚乳中克隆到該轉錄因子，該基因含有一個編碼391個氨基酸的開放閱讀框。其他植物氨基酸序列進行同

5、源比對，發(fā)現ZmNAM056轉錄因子含有NAC轉錄因子特有的N端DNA結合結構域和C端轉錄激活結構域。
　　2、對ZmNAM056基因表達模式進行了分析。半定量PCR結果表明ZmNAM056基因在籽粒中特異表達;隨后實時熒光定量PCR，結果表明ZmNAM056基因在授粉后前7天的籽粒中表達量較低，授粉后10天開始大量表達，授粉后20天達到最高，并且發(fā)現同玉米胚乳淀粉合成相關基因表現出極強的正相關。同時還研究了不同糖類和植物激素對胚

6、乳淀粉合成相關基因及ZmNAM056基因表達的影響，結果發(fā)現其中AGPase基因Brittle-2、Shrunken-2在所處理條件下其表達趨勢是一致的，都受Glu、Suc、ABA的誘導，Fru、Tre的抑制;淀粉合成酶類(SSs)基因，SSⅡa受Glu的顯著誘導，卻不受ABA的誘導，SSⅢa受ABA的顯著誘導，卻不受Glu的誘導，SSⅠ受Glu跟ABA的顯著誘導;淀粉合成分支酶類(SBE)基因BEI受Tre、Suc的顯著誘導，而SBE

7、Ⅱb受Fru、Glu的顯著誘導。這些結果說明同一個基因在不同處理條件下，其表達是有很大差異的，不同基因在相同條件處理時，有些基因的表達趨勢是一致的，而有些表達趨勢又是有差異的。其中蔗糖、葡萄糖、ABA對這些基因的表達影響較大。ZmNA M056基因的表達卻不受蔗糖的影響;激素ABA跟葡萄糖促進ZmNAM056基因的表達，有趣的是蔗糖跟ABA協同處理時，促進效果更明顯。
　　3、構建35S∷ZmNAM-GFP融合蛋白表達載體，通過基

8、因槍轟擊介導洋蔥表皮細胞進行亞細胞定位，結果表明Zm NA M056編碼蛋白定位于細胞核中;通過酵母轉化實驗分析表明，ZmNAM056基因編碼蛋白具有轉錄激活性。同時克隆玉米ZmNAM056蛋白的編碼序列連接入pET-28載體，在大腸桿菌RosettaTM(DE3)菌株中進行原核表達，然后通過Ni-Agarose柱純化6×His-ZmNAM056融合蛋白。
　　4、通過基因槍轟擊介導玉米胚乳的瞬時表達實驗以及酵母單雜交實驗驗證轉錄