HMGB1在RNA聚合酶Ⅲ識別poly(da-dT)中的作用及機制.pdf

1、研究發(fā)現(xiàn),外源及自身DNA可通過胞內DNA感受器啟動固有免疫應答,近年來對新型DNA感受器的鑒定及其功能調控迅速成為免疫學領域的新興方向和重要學術關注。
　　 在本研究中,為了探討HMGB1在新型DNA感受器PolⅢ識別外源DNA中的作用機制,我們首先通過Real-time PCR檢測poly(dA-dT)刺激后細胞內HMGB1在mRNA水平上的表達情況。結果顯示,HMGB1在293T細胞內上調達40倍,在Raw264.7細胞中

2、上調約7倍。接下來,我們分析了HMGB1在PolⅢ識別poly(dA-dT)產生IFN-β中的作用。當使用ML60218抑制劑特異性阻斷PolⅢ的活性后,IFN-β的表達水平顯著下降,且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性;當ML60218使用濃度為10μM時,IFN-β的表達相比未抑制組下調5倍左右,表明DNA感受器中PolⅢ對IFN-β的產生發(fā)揮關鍵性作用。隨后,我們通過調控細胞內HMGB1的表達量來探討其在PolⅢ-RIG-Ⅰ通路中作用。在HMG

3、B1上調表達過程中,因HMGB1的本底表達水平較高,我們未觀察到HMGB1對IFN-β產生的影響;在HMGB1下調表達過程中,我們以攜帶特異性shRNA的慢病毒載體穩(wěn)定下調HMGB1表達后發(fā)現(xiàn),poly(dA-dT)刺激細胞產生IFN-β的能力大幅下降,約8倍左右,表明HMGB1參與了PolⅢ對外源DNA的識別過程。
　　 為了進一步研究HMGB1和PolⅢ在細胞內可能存在的相互作用,我們運用了免疫共沉淀技術和熒光共定位分析。免

4、疫共沉淀實驗中,我們以HMGB1為誘餌蛋白,檢測免疫沉淀復合物中帶有Flag標簽PolⅢ亞基POLR-3D的表達。結果顯示,HMGBl與PolⅢ不存在直接相互作用。但在熒光共定位實驗中,我們發(fā)現(xiàn)帶有不同熒光蛋白標簽的PolⅢ亞基POLR-3D和HMGB1,在293T和Raw264.7細胞內存在共定位,這一現(xiàn)象提示HMGB1可能通過間接結合方式調控了PolⅢ對外源DNA的識別及下游Ⅰ型干擾素的分泌過程。
　　 本研究著重探討胞質D