簡介：本文選擇了具有重大社會效益和經濟效益的抗乙肝病毒新藥阿德福韋酯作為研究內容。我國是慢性乙型肝炎高發(fā)區(qū)，人群中慢性乙型肝炎病毒HBV攜帶者有12億，慢性肝炎患者有3400萬，而目前世界上公認對慢性乙肝治療有效的抗病毒藥物干擾素和拉米夫定由于其自身的缺陷在臨床使用中受到一定的限制，許多乙肝患者得不到有效的治療，最終發(fā)展為肝硬化、肝癌直至死亡。阿德福韋酯是一個新的抗病毒藥物，到目前為止的研究表明它能減少各種慢性乙肝患者的病毒負荷，包括HBEAG陽性和HBEAG陰性的慢性乙肝病人、代償性肝病的慢性乙肝病人和拉米夫定耐藥的慢性乙肝病人；與安慰劑相比，它能明顯改進肝炎病人的病毒學、血清學、組織學和生化指標；到目前為止，未檢測到阿德福韋酯耐藥變異；其安全性極好，適合于長期治療。所有的研究結果都支持阿德福韋酯作為乙肝治療的一線藥物。因此，阿德福韋酯的研制成功，將填補國內慢性乙肝病人缺少有效藥物治療的現(xiàn)狀，病人應用阿德福韋酯后不必再受病毒變異問題的困擾，可獲得長期有效的治療，對那些應用拉米夫定后出現(xiàn)耐藥的病人有了新的選擇或補充治療方法，具有重大的社會效益和經濟效益。本文通過對阿德福韋酯原料藥及其片劑的臨床前研究，包括藥物的合成工藝、處方篩選、質量研究和質量標準的建立、包裝和穩(wěn)定性研究、藥理毒理研究，完成了阿德福韋酯由化工產品向安全有效、質量可控藥物的轉變，實現(xiàn)了質的飛躍，特別是通過對結晶工藝的研究，發(fā)現(xiàn)了國外專利保護的四種晶型以外的阿德福韋酯新的結晶形態(tài)，有效地突破了國外專利封鎖，并通過申請專利使之擁有自主知識產權該專利即將授權。通過對新晶型阿德福韋酯與國外上市產品專利報道Ⅰ型阿德福韋酯理化性質與生物活性的比較研究，證明兩種晶型的阿德福韋酯理化性質相近、生物等效，這樣就保證了新晶型阿德福韋酯的安全性和有效性，為其進一步的臨床研究及實現(xiàn)本土產品的國內上市打下了良好的基礎。該項目于2002年12月申報國家食品藥品監(jiān)督管理局申請臨床研究，并一次性地通過了國家藥品審評中心的審評，這說明針對新晶型阿德福韋酯原料藥及其片劑進行的藥品安全性、有效性及質量可控性的研究得到了國家藥品審評中心的肯定，已于2003年7月取得臨床批件，臨床研究正在進行中，預計2005年在國內上市。

簡介：【目的】研究AEDS對不同腦發(fā)育期大鼠認知功能的影響，初步探討AEDS損害認知功能的可能機制?！痉椒ā恳陨蟮?天POSMATALDAY8，P8及P15幼年WISTAR鼠為研究對象，分組予苯巴比妥PHENOBARBITAL，PB30MGKG，QD、丙戊酸鈉VALPROATESODIUM，VPA150MGKG，BID、托吡酯TOPIRAMATE，TPM40MGKG，BID連續(xù)灌胃用藥7天，對照組服用羧甲基纖維素鈉CARBOXYMETHYLCELLULOSE，CMC代替。給藥結束后將各組動物分為兩部分，其中一半取血測定PB、VPA血藥濃度、測量腦重，并用TUNEL染色法檢測神經細胞凋亡情況，電鏡觀察海馬突觸形態(tài)。免疫組化法檢測突觸素SYNAPTOPHYSIN，SYP及腦源性神經營養(yǎng)因子BRAINDERIVEDNEUROTROPHICFACTBDNF的表達的變化。另一半實驗動物連續(xù)喂養(yǎng)，并分別于給藥結束后第7天及P60齡時予MRIS水迷宮檢測其學習記憶與空間定位能力，于實驗結束時P65處死動物，檢測腦組織內SYP的表達。【結果】1與同期實驗對照組比，生后8天使用PB、VPA后，大鼠顳葉皮層及海馬CA3區(qū)神經細胞凋亡發(fā)生率顯著升高P001，大鼠腦重量減低P001；海馬CA3區(qū)突觸素積分光密度INTEGRATEDOPTICALDENSITY，IOD顯著降低P001，且顳葉皮層及海馬CA3區(qū)神經細胞BDNFIOD顯著降低P001。電鏡下，突觸前膜囊泡數(shù)量減少，突觸間隙增寬。MRIS水迷宮檢測，大鼠尋臺逃避潛伏期較對照組顯著延長P001，穿越平臺次數(shù)較對照組顯著減少P001。隨訪至生后65天P65時，實驗組大鼠腦重和海馬CA3區(qū)突觸素IOD仍顯著低于對照組P005。2生后15天服用PB、VPA的大鼠，無論其顳葉皮層及海馬CA3區(qū)凋亡神經細胞數(shù)量、腦重，還是海馬CA3區(qū)突觸素IOD、顳葉皮層及海馬CA3區(qū)BDNFIOD與對照組相比均無顯著性差異，電鏡觀察突觸無明顯形態(tài)學改變。大鼠尋臺逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)與對照組比較也無顯著差異。3無論是生后8天，還是15天服用TPM，與對照組相比，大鼠的顳葉皮層及海馬CA3區(qū)凋亡神經細胞數(shù)量、腦重、海馬CA3區(qū)突觸素IOD、顳葉皮層及海馬CA3區(qū)BDNFIOD均無顯著性差異，電鏡觀察突觸無明顯形態(tài)學改變。大鼠尋臺逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)與對照組比較也無顯著差異?！窘Y論】1在腦快速生長發(fā)育期PB、VPA能夠促進海馬及顳葉皮質神經細胞凋亡，海馬突觸生長不良，減低大鼠腦重，造成認知功能損傷。而此種腦形態(tài)與功能的損害，呈現(xiàn)不可逆性。2PB、VPA對大鼠腦發(fā)育及認知功能損害存在敏感期，腦快速生長期后，服用PB、VPA未發(fā)現(xiàn)對大鼠腦發(fā)育及功能存在明顯影響。3TPM對快速生長期大腦未產生明顯結構與功能異常，可以成為小年齡癲癇治療的適當用藥。4神經細胞內BDNF表達的變化及其影響的突觸變化在PB、VPA引起的大鼠腦發(fā)育及認知功能異常中起重要作用。

簡介：目的本項研究是由劉艷驕導師領導的課題組承擔的中國科協(xié)科普基金資助項目“中醫(yī)藥知識傳播中的公眾認知度及效果評價”的一部分從理論和實際出發(fā)探索中醫(yī)藥學知識在傳播過程中所存在的問題探討解決公眾對中醫(yī)藥知識模糊認識的途徑以及中醫(yī)藥知識傳播方式的新方法。其中結合本專業(yè)還探討了公眾對中醫(yī)治療睡眠障礙的認知度為睡眠障礙的研究提供更多的依據(jù)。了解我國公眾對中醫(yī)藥基本知識認知的現(xiàn)狀、特征及存在問題是建設提高我國公眾對中醫(yī)認知度的前提并在現(xiàn)狀分析的基礎上結合我國國情對影響我國公眾中醫(yī)藥知識認知度的因素進行分析總結把握各個因子的作用機理和渠道為政府決策提供建議。因此本課題的研究可以更好地協(xié)助政府和有關部門了解中國公眾對中醫(yī)藥知識的理解問題促進我國中醫(yī)藥知識的傳播同時也有利于更好地使用中醫(yī)藥為公眾服務。方法和內容本項研究所采用的研究方法主要采用調查研究方法內容包括網絡調查、現(xiàn)場問卷調查的方法。本調查主要采取問卷的形式以封閉型問卷類型為主。具體方法主要包括1采用隨機抽樣調查方法。邀請國家統(tǒng)計局城市調查大隊協(xié)助進行統(tǒng)計設計以使隨機抽樣調查更加準確和科學。2按照科研的需要撰寫調查策劃書并請有關部門的專家審閱確立調查的內容進行調查問卷的設計。3利用現(xiàn)有條件查閱古代及現(xiàn)代文獻按照文獻學研究方法對古代醫(yī)家傳播中醫(yī)藥知識的方式、方法進行研究以吸取他們的智慧和經驗。4根據(jù)全民科學素養(yǎng)調查的經驗采用媒體報刊或網絡進行公開的調查問卷并對踴躍參與者由公司給予適當?shù)莫剟睢?用EXCEL、SPSS13O進行統(tǒng)計學處理與分析。本課題主要包括現(xiàn)場調查和睡眠障礙網絡調查兩部分。其中現(xiàn)場調查包括六個部分基礎數(shù)據(jù)中醫(yī)藥基礎知識中醫(yī)藥知識的傳播睡眠障礙的中醫(yī)治療中醫(yī)學與社會及效果評價。睡眠障礙網絡調查包括兩個部分一般情況和常見睡眠障礙知識的了解程度結果現(xiàn)場調查共收集問卷896份剔除退出及無效問卷121份1350％故共收集有效問卷775份。通過現(xiàn)場調查發(fā)現(xiàn)大多數(shù)被調查人對中醫(yī)理論的認識還是正確的對中醫(yī)事業(yè)的發(fā)展也比較支持。睡眠障礙網絡調查共有1317人參與時間持續(xù)三個月。從調查結果可以看出大多數(shù)人對睡眠障礙并沒有足夠的了解。對于出現(xiàn)睡眠障礙后進行過中醫(yī)治療的患者大多數(shù)人都對中醫(yī)治療效果表示肯定。結論從調查的結果看中醫(yī)學還是有發(fā)展的。中醫(yī)要發(fā)展只能靠療效同時也需要政府的支持和社會的認可。通過睡眠障礙網絡調查發(fā)現(xiàn)人群中對中醫(yī)治療睡眠障礙的看法還存在一定的差距。人群中在出現(xiàn)睡眠障礙時多數(shù)人選擇的是忍耐通過對服用中藥的調查看出人們對中醫(yī)睡眠醫(yī)學的理論了解的不很多。人們對中醫(yī)藥治療的最大感受是改善癥狀提高生存質量。

簡介：目的探討構建攜帶人堿性成纖維生長因子BFGF的重組慢病毒載體方法并觀察堿性成纖維細胞生長因子基因轉染大鼠骨髓間充質干細胞后BFGF目的基因的表達情況。方法采用RTPCR擴增的方法獲取人源性的BFGF與FGF4基因，將目的基因與載體PGCFU連接含綠色熒光蛋白GFP。產生PGCFUFGF4BFGF慢病毒載體。PCR篩選陽性克隆，測序鑒定。通過LIPOFECTAMINE2000的介導把PGCFUFGF4BFGF載體，PHELPER10載體和PHELPER20載體三質粒共轉染至包裝細胞293T應用REALTIMEPCR法鑒定和測定滴度。而后轉染大鼠骨髓間充質干細胞并檢測其表達。MTT法檢測到間充質干細胞經過基因修飾以后和未經過基因修飾的干細胞生長情況結果⑴流式細胞儀顯示體外分離培養(yǎng)的第3代大鼠骨髓間充質干細胞表面抗原表達CD11BC陽性細胞表達率為142％±07％，CD34陽性細胞表達率為13％±05％，CD44陽性細胞表達率978％±09％，CD90陽性細胞表達率969％±15％。⑵PCR鑒定證實重組慢病毒有人FGF4信號肽人BFGF，病毒滴度為200E9TUML。⑶轉染大鼠骨髓間充質干細胞后，行RTPCR檢測到BFGF基因轉入干細胞內，其大小約500BP。⑷在熒光顯微鏡下，觀察到轉染的干細胞內GFP的表達；通過WESTERNBLOT檢測轉染的細胞可以觀察到36～55KDR之間有明顯表達，與FGF4BFGFGFP融合蛋白2128KDR49KDR基本吻合。備注構建的PGCFUFGF4BFGF基因插入片斷大小549BP綜上基本判斷FGF4BFGF表達正常。ELISA檢測結果表明轉染BFGF的細胞培養(yǎng)上清液中堿性成纖維細胞生長因子濃度顯著高于空白對照。⑸MTT法檢測到間充質干細胞經過基因修飾以后和未經過基因修飾的干細胞生長情況對比，基因修飾后的目的細胞明顯優(yōu)于未經修飾的干細胞。結論成功構建的攜帶人成堿纖維生長因子的慢病毒載體能在293T細胞擴增獲得足夠高的病毒滴度，并轉染入大鼠骨髓間充質干細胞，經檢測可以有效的表達?？梢詾橄乱徊交蛑委煷笫笙轮毖峁┖芎玫幕A。

簡介：蘭州大學碩士學位論文植物雌激素對去卵巢血管性癡呆大鼠認知功能和海馬膽堿乙酰轉移酶表達的影響姓名陳明申請學位級別碩士專業(yè)人體解剖與組織胚胎學指導教師宋焱峰侯一平20051201蘭州大學碩士學位論文察去卵巢VD大鼠各組海馬膽堿能神經元的數(shù)目。結果與OVX組相比，OVXEST組及OVXPHY組的大鼠海馬膽堿能神經元數(shù)目明顯升高PO．05。結論1去卵巢VD大鼠經普通食物喂養(yǎng)后大腦海馬結構CHAT表達下降，同時伴隨空間記憶能力表達下降；2去卵巢VD大鼠經普食添加雌激素或植物雌激素飼養(yǎng)后，大腦空間記憶能力及海馬結構CHAT的表達和未去除卵巢VD大鼠相比無統(tǒng)計學意義；3植物雌激素具有雌激素樣作用，能增強大鼠海馬膽堿能神經元的表達，提高記憶、預防和治療VD疾病的發(fā)生。關鍵詞植物雌激素；膽堿乙酰轉移酶；海馬；去卵巢大鼠；血管性癡呆II

簡介：近年來，性傳播疾病STD逐年增多，而其中尖銳濕疣CA的發(fā)病率占性病構成比的2473％，居第二位。人乳頭瘤病毒HPV型別眾多，而尖銳濕疣主要是由HPV11型引起的。HPV基因組中的晚期區(qū)基因L1編碼主要衣殼蛋白，具有穩(wěn)定的免疫原性。在原核表達系統(tǒng)中，L1基因表達后可自行組裝成不含病毒DNA的病毒樣顆粒VLPS。VLPS具有與天然病毒相似的空間構象、免疫特性和生物學活性，因此以LL為保護性抗原構建的疫苗在預防HPV感染方面發(fā)揮著重要的作用。本研究首先從天津地區(qū)尖銳濕疣患者新鮮組織標本中提取HPVDNA，并用PCR方法對其進行分型，篩選出HPV11型病毒DNA。用PCR擴增出帶有酶切識別位點的HPV11L1基因片段。利用PCR產物兩末端帶有的單個A堿基，與帶有單個T堿基末端的PMDL8T載體借助堿基互補連接，構建成質粒PMDL8THPV11L1，并進行了酶切鑒定以及L1基因的PCR鑒定和序列分析。從該質粒中酶切獲取L1基因片段，并將其插入帶有相同粘性末端的表達載體質粒PET42A構建成表達HPV11L1蛋白的重組表達質粒PET42AHPV11L1，并對其進行了酶切以及L1基因的PCR鑒定和序列分析。最后對該重組表達質粒PET42AHPV11L1在大腸桿菌BL21DE3中進行了初步表達。本研究將HPV11型L1基因克隆入PET42A原核表達載體，成功構建了PET42AHPV11L1，并在大腸桿菌中得到了高效表達，為進一步展開HPV疫苗的研究創(chuàng)造條件。

簡介：腸道病毒71型EV71屬于人類小核糖核酸病毒科腸道病毒屬腸道病毒A種病毒，同柯薩奇病毒16型CA16一道，是引發(fā)手足口病HFMD的兩種主要病原體。雖然手足口病的臨床癥狀表現(xiàn)為輕微的發(fā)疹及發(fā)燒癥狀，但是EV71病毒的感染能夠引發(fā)嚴重的神經疾病，如致死性腦炎，無菌性腦膜炎，急性松弛性麻痹，而CA16病毒的感染一般不會導致這些疾病。EV71病毒主要感染小孩，特別是嬰幼兒，其病毒于1969年在加利福尼亞的一個患有致死性腦炎的9個月大的嬰兒中第一次分離得到的。手足口病在很多國家和地區(qū)中廣泛流行著。近年來，在馬來西亞、新加坡、臺灣、日本、韓國、越南和中國大陸等東南亞和東亞的國家和地區(qū)經常會有手足口病的大爆發(fā)。目前由于沒有合適的疫苗和抗病毒藥物，還不能治療由EV71感染導致的手足口病。在EV71感染過程中會發(fā)生依賴于抗體的病毒感染增強現(xiàn)象，這給疫苗治療制造了一些困難?？贵w這種被動免疫治療的藥物，也許是治療手足口病的新希望。在本實驗中我們選用EV71HM003207病毒株，該病毒株屬于目前國內EV71感染病例中最常見的病毒C4亞型。用EV71活病毒、VP1GST融合蛋白以及偶聯(lián)上血藍蛋白KLH的SP55、SP70和VP228三條中和線性表位肽作為三種免疫原成分免疫BALBC小鼠，而后雜交瘤細胞技術結合酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA，篩選到了14株強結合型單克隆抗體。在橫紋肌瘤細胞RD和神經細胞SKNSH上檢測單克隆抗體的中和保護作用，結果顯示有四株單克隆抗體在RD細胞和SKNSH細胞上都表現(xiàn)出中和保護作用2B6、12B6、6G5、2G12，有兩株單克隆抗體只在SKNSH細胞中表現(xiàn)出中和保護作用7E6、7G6，而僅有一株單克隆抗體僅在RD細胞上表現(xiàn)出中和保護作用1G6。本實驗在細胞水平上建立檢測抗EV71單克隆抗體的中和保護作用模型獲得的單克隆抗體可為后續(xù)人源化改造提供原材料同時篩選到不同中和保護類型的抗體，可用于病毒致病機理的相關研究。

簡介：分類號UDC_中韻密級1734901編號～～摯CENTRALSOUTHUNIVERSITY碩士學位論文論文題目用于誘導多潛能性干細胞的入羊水細胞培養(yǎng)及逆轉錄病毒包裝平臺的建立學科、專業(yè)研究生導師指導小組遺傳學高庭梁德生教授劉雄昊副教授潘乾高級實驗師中南大學二00年六月碩士學位論文IRILLIIIRLIIIRRIRLRIIY1718578密級用于誘導多潛能性干細胞的人羊水細胞培養(yǎng)及逆轉錄病毒包裝平臺的建立THEESTABLISHMENTOFTHEPLATFORMFORHUMANAMNIOTICFLUIDCELLCULTURINGANDRETROVIRUSPACKAGINGFORINDUCINGPLURIPOTENTSTEMCELLS作者姓名高庭學科專業(yè)遺傳學學院系、所國家生命科學技術與人才培養(yǎng)基地基因科學與技術產業(yè)化點導師梁德生教授指導小組劉雄昊副教授潘中南2010∞號類分一11F

簡介：本實驗利用AAV包裝平臺RAAVHELPERFREESYSTEM，構建攜帶人VEGF165基因的重組AAV和攜帶EGFP報告基因的重組AAV載體，并初步研究攜帶人VEGF165基因的AAV載體在對間充質干細胞MESENCHYMALSTEMCELLS，MSCS和心肌的表達情況，為下一步在體治療大鼠心力衰竭的動物實驗奠定基礎。第一部分基因重組HVEGF165腺相關病毒載體和基因重組增強型綠色熒光蛋白腺相關病毒載體的包裝目的應用基因工程和分子生物學技術構建包裝病毒用載體質粒，并以三質粒共轉染方法包裝HVEGF165腺相關病毒和增強型綠色熒光蛋白ENHANCEDGREENFLUESCENCEPROTEIN，EGFP腺相關病毒。方法1質粒PCDNA3HVEGF165質粒用BAMHⅠ和XBAⅠ雙酶切獲得576BP的HVEGF165CDNA全長片斷，電泳膠回收備用。PCMVMCS質粒用BAMHⅠ和XBAⅠ雙酶切，膠回收開環(huán)質粒DNA。HVEGF165CDNA片斷和開環(huán)PCMVMCS定向連接，構建過渡質粒PCMVHVEGF165。所構建質粒電穿孔轉化ECOLIDH5Α感受態(tài)細菌，挑取菌落克隆擴增培養(yǎng)提取質粒后酶切、PCR和測序等方法鑒定。測序引物上下游分別位于PCMVHVEGF165質粒的BETAGLOBININTRON和HGHPA中，擴增片斷長度876BP，電泳結果和測序結果準確無誤后，進行下一步實驗。2為了避免克隆過程中ITR的丟失引起病毒包裝效率下降，以NOTⅠ酶切質粒PCMVHVEGF165和AAV載體質粒PAAVMCS，行電泳、膠回收含PAAVITR的片斷和PCMVHVEGF165真核表達框，兩者連接構建質粒PAAVHVEGF165。所構建質粒電穿孔轉化ECOLIDH5Α感受態(tài)細菌，挑取菌落克隆擴增培養(yǎng)提取質粒后用雙酶切、PCR和測序等方法鑒定。PCR鑒定引物上下游分別位于PAAVHVEGF165上下游LITR和RITR中，共擴增2976BP片斷；以NOTⅠ和PSTⅠ雙酶切PAAVHVEGF165質粒，可以切出約140BP大小的ITR片斷；測序引物同PCMVHVEGF165測序引物。3包裝病毒用質粒PAAVEGFP構建流程同PAAVHVEGF165。首先根據(jù)EGFP上下游序列設計引物，上游引物5’AGAGTCGACAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3’引入SALⅠ酶切位點；下游引物5’GAGAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG3’引入BGLⅡ酶切位點。以質粒PEGFPN1為模板，進行PCR，擴增出720BP兩端分別帶有SALⅠ酶切位點和BGLⅡ酶切位點的EGFP片段，SALⅠ和BGLⅡ雙酶切PCR產物膠回收后定向連接入用SALⅠ和BGLⅡ雙酶切的PCMVMCS開環(huán)質粒DNA中，獲得PCMVEGFP質粒，電穿孔轉化ECOLIDH5Α感受態(tài)細菌，挑取菌落克隆擴增培養(yǎng)提取質粒后行雙酶切、PCR和測序等方法鑒定。以NOTⅠ酶切質粒PCMVEGFP和AAV載體質粒PAAVMCS，行電泳后膠回收含PAAVITR的片斷和PCMVEGFP真核表達框，兩者進行連接，構建質粒PAAVEGFP。所構建質粒電穿孔轉化ECOLIDH5Α感受態(tài)細菌，挑取菌落克隆擴增培養(yǎng)，提取質粒后PCR產物電泳、酶切和測序鑒定4培養(yǎng)HEK293細胞，待HEK293細胞長至8090％融和，取PAAVHVEGF165或PAAVEGFP、PRC和PHELPER電轉化共轉染HEK293細胞，包裝RAAVHVEGF165或RAAVEGFP，取電轉化培養(yǎng)72小時后的HEK293細胞進行氯仿處理NACL沉淀氯仿抽提3個步驟，分離濃縮和純化RAAV，純化后RAAV通過AVSACHTMELISA法測定RAAV顆粒滴度，用SDS聚丙烯酰胺凝膠SDSPAGE電泳考馬斯亮藍染色觀察檢測RAAV的衣殼蛋白，將純化后的RAAV病毒樣本磷戊酸負染電鏡下觀察。結果本實驗利用基因工程和分子生物學技術構建PCMVHVEGF165和PCMVEGFP過渡質粒，然后再克隆入AAV載體質粒構建PAAVHVEGF165和PAAVEGFP，目的是為了防止PAAV質粒中的ITR在操作過程中的丟失而影響病毒包裝效率。所有質粒PCR產物電泳結果、酶切結果和測序結果正確無誤，并保證了PAAVHVEGF165和PAAVEGFP質粒中ITR的存在。應用電穿孔方法三個質粒共轉染HEK293細胞，分離純化后獲得高滴度和純度的RAAVHVEGF165和RAAVEGFP。包裝純化后獲得病毒滴度可達到21011，SDSPAGE電泳考馬斯亮藍染色可見3條特征性AAV衣殼蛋白條帶，電鏡觀察病毒顆粒均勻，病毒大小20～25NM，呈多面體形態(tài)。重組AAV載體包裝成功，為后繼體外細胞實驗研究奠定了基礎。第二部分大鼠間充質干細胞和乳鼠心肌細胞的培養(yǎng)和鑒定目的建立大鼠MSCS和心肌細胞的培養(yǎng)和純化條件。方法1MSCS的分離、培養(yǎng)和擴增無菌條件下將4只46周雄性WISTAR大鼠120150克股骨骨髓腔沖洗液用培養(yǎng)液洗滌2次后，小心吹打成單細胞懸液，以4105CM2接種細胞于培養(yǎng)瓶，同時加入100UML青霉素及100ΜGML鏈霉素，于37℃，5％CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用倒置顯微鏡逐日進行觀察。接種72小時后換液，去除懸浮的造血干細胞及血細胞，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后每三天換液一次。2乳鼠心肌細胞的分離和培養(yǎng)取15只出生后13天的WISTAR大鼠，斷頸處死，在裝有75％酒精的燒杯中浸泡5分鐘消毒，在超凈工作臺中，無菌條件下取出大鼠心臟，放在裝有無菌1PBS的無菌培養(yǎng)皿中，用在無菌1PBS反復沖洗后，用眼科剪小心將心臟剪成≤1MM3的碎塊，用0125％的胰蛋白酶消化液進行消化，去掉首次消化的上清，收集后面消化的上清，直至心臟碎塊呈現(xiàn)白色纖維狀，用10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細胞2次，用吸管將細胞培養(yǎng)液吹打均勻，加入終濃度為100UML青霉素及100ΜGML鏈霉素后，移入細胞培養(yǎng)瓶中。放入37℃，5％CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)90分鐘后差速貼壁，吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，以3105細胞ML接種于新的培養(yǎng)瓶中，同時加入BRDU至01MMOLL，12小時后更換培養(yǎng)液。以后，每隔3天換液一次。培養(yǎng)34天后，細胞達到融合狀態(tài)進行實驗。3應用HE染色和免疫細胞化學染色對培養(yǎng)細胞進行鑒定。結果1培養(yǎng)出大鼠MSCS，對第3代細胞進行鑒定，95％以上為大鼠MSCS。2培養(yǎng)出乳鼠心肌細胞，95％為乳鼠心肌細胞。為下一步實驗奠定了細胞基礎。第三部分基因重組野生型HVEGF165腺相關病毒載體在間充質干細胞和心肌細胞表達的實驗研究目的利用攜帶HVEGF165的基因重組AAV轉染MSCS和心肌細胞進行體外實驗研究，觀察其在這兩種細胞的表達情況。方法1體外培養(yǎng)大鼠MSCS和乳鼠心肌細胞方法同前。2以不同劑量RAAVEGFP1104、1105、1106、1107、2106VPCELL轉染大鼠MSCS和乳鼠心肌細胞96小時后用倒置熒光顯微鏡觀察細胞表達綠色熒光蛋白情況。3RAAVHVEGF165以1107VPCELL轉染MSCS，以1106VPCELL轉染乳鼠心肌細胞，用雙抗體夾心ELISA法測定第4、7、10天的培養(yǎng)上清中的VEGF濃度。結果1RAAVEGFP轉染大鼠MSCS和乳鼠心肌細胞后96小時熒光顯微鏡下可見細胞表達綠色熒光，以不同劑量1104、1105、1106、1107、2106VPCELL感染細胞后可見熒光細胞數(shù)比例MSCS為3％，29％，38％，53％，57％；乳鼠心肌為7％，33％，55％，57％，59％。RAAVEGFP在大鼠MSCS和乳鼠心肌細胞中可以表達攜帶的外源基因EGFP。3以1107VPCELL轉染大鼠MSCS和以1106VPCELL轉染乳鼠心肌細胞后，分別在第4、7、10天檢測培養(yǎng)上清液中的VEGF濃度，均呈逐漸升高趨勢，并且顯著高于空病毒對照組和未感染組，表明構建的重組AAV可以有效的轉染兩種細胞，并且穩(wěn)定表達。結論成功構建HVEGF165腺相關病毒和增強型綠色熒光蛋白腺相關病毒，轉染大鼠MSCS和乳鼠心肌細胞體外實驗表明，重組AAV在兩種細胞內可以持續(xù)穩(wěn)定的表達VEGF蛋白，為下一步體外實驗治療大鼠心力衰竭的實驗奠定基礎。

簡介：浙江大學碩士學位論文溶瘤病毒對結直腸腫瘤細胞的選擇性殺傷作用姓名周瑋申請學位級別碩士專業(yè)腫瘤學指導教師何超20070401浙江大學醫(yī)學院2007屆碩士學位論文【結果】1、腺病毒體外復制能力的測定用AD／HTERTGFP．E1及AD／CMVGFP感染DLDI細胞48H后，在光鏡下見AD／HTERTGFP．E1感染的DLDI細胞出現(xiàn)細胞病變效應CYTOPATHICEFFECTCPE，在熒光顯微鏡下觀察到有明顯的GFP表達，感染了AD／CMUGFP的DLDL細胞中也可見GFP表達，但細胞形態(tài)無明顯變化，而感染這兩種病毒的正常人成纖維細胞NORMALHUMANFIBROBLAST，NHFB細胞未見任何CPE且僅見極少量的GFP表達；一周后取以上細胞裂解液感染DLDL細胞，結果顯示用感染AD／HTERTGFP．E1的DLDL裂解液再次感染48H后仍可見明顯的CPE及GFP表達，而其他的細胞裂解液均未造成類似的效果。對上述裂解液進行TCID50測定后結果表明DLDL細胞感染AD／HTERTGFP．E1的裂解液后病毒滴度明顯高于感染AD／CMVGFP的裂解液，而在NHFB細胞分別感染上述兩種病毒的裂解液后病毒滴度無明顯差異。2、溶瘤病毒對大腸癌細胞的體外殺傷作用選擇不同滴度的病毒感染正常細胞NI王FB及大腸癌細胞DLDL、HCT8、LOVO、SWLL6、HCTLL6，5天后MTT法測定其細胞活力，結果表明AD／HTERTGFP．E1對NHFB沒有殺傷作用，而對大腸癌細胞均有明顯的殺傷作用，而且殺傷作用與病毒濃度存在劑量依賴關系，AD／CMVG】砷對以上腫瘤細胞都無明顯的抑制作用；用250M01的兩種病毒分別感染LOVO和NHFB后，在第3、5、7、9天測定細胞活力，結果顯示AD／HTERTGFP．E1對LOVO的殺傷作用隨作用時間增加而增強，而N既馮細胞的相對活力與感染時間不存在相關性；細胞克隆形成試驗結果也顯示AD，HTERTGFP．EL能夠顯著抑制腫瘤細胞克隆形成，該抑制作用存在劑量依賴關系。3、凋亡檢測分別用500MOI的AD，HTERTGFP。E1及AD／CM、，GFP感染DLDL細胞48小時后用原位細胞凋亡試劑盒進行凋亡檢測，結果顯示AD／HTERTGFP．E1作用后細胞凋亡率較AD／CMVGFP及PBS處理后明顯增加，細胞計數(shù)后的結果顯示PBS組、AD／CMV．GFP組、AD／HTERL二GFP．E1組的凋亡率為分別為1．44±0．15％、1．75±0．47％、10．75±1．24％，AD／HTERL二GFP，E1所引起的凋亡率顯著高于其他兩個對照組PO．01?！窘Y論】1、溶瘤腺病毒AD／HTERTGFPE1能夠選擇性地在腫瘤細胞內復制，并且能夠在長時間內維持較高的病毒滴度；2、AD／HTERTGFPE1能夠選擇性地殺傷腫瘤細胞，而對人正常纖維細胞都沒有毒性作用；3、溶瘤病毒殺傷腫瘤細．2．

簡介：全文分為六部分第一部分含CDUPRT融合基因的逆轉錄病毒表達載體的構建與病毒包裝目的建立含CDUPRT融合基因的重組逆轉錄病毒表達載體，包裝含目的基因的重組逆轉錄病毒。方法根據(jù)逆轉錄病毒表達載體PLXSN的多克隆位點及PF5CDUPRT質粒上CDUPRT的基因序列，設計PCR引物，在引物的5’端分別引入ECⅠ和BAMHⅠ酶切位點，采用常規(guī)PCR從PF5CDUPRT中擴增出CDUPRT融合基因，經核酸序列測定正確后，分別克隆進入PLXSN和LZRSPBMNZ。經雙酶切鑒定無誤后，轉染包裝細胞PT67和PHEONIX，擴大培養(yǎng)陽性克隆，收集上清，獲得重組逆轉錄病毒。結論成功構建逆轉錄病毒表達載體LZRSCDUPRT和PLXSNCDUPRT，收獲含CDUPRT基因的重組逆轉錄病毒。第二部分穩(wěn)定表達CDUPRT的C6細胞株的建立與鑒定目的建立能穩(wěn)定表達CDUPRT的C修飾細胞株，為CDUPRT聯(lián)合基因治療建立研究平臺。方法以含重組質粒PLXSNCDUPRT和空質粒PLXSN的重組逆轉錄病毒分別轉染C6細胞，加入終濃度為8ΜGML的聚凝胺輔助病毒轉染，設立無病毒轉染的C6細胞對照組，轉染時32℃1000G離心30分鐘以提高病毒轉染率。轉染6小時后更換新鮮培養(yǎng)液，24小時重復轉染一次，末次轉染后48小時加入終濃度為200ΜGML的G418，篩選14天。篩選14天后對抗性細胞克隆進行擴大培養(yǎng)培養(yǎng)液10％FCSRPML1640，所獲抗性細胞分別命名為C6CDUPRT和C6PLXSN，電泳驗證各細胞導入基因，并比較C6CDUPRT和原C6的生物學特性。結論成功地通過重組逆轉錄病毒的介導將目的基因CDUPRT轉導至大鼠膠質瘤細胞株C6中，經傳代培養(yǎng)鑒定證明目的基因獲得穩(wěn)定有效表達，C6CDUPRT細胞株傳代等生物學特性與原代細胞C6無差異。第三部分CDUPRT5FC基因治療方案對膠質瘤細胞C6的殺傷作用及殺傷機理的研究目的觀察CDUPRT5FC基因治療方案對修飾C6膠質瘤細胞的殺傷作用，并且探討可能的殺傷機理。方法設C6CDUPRT為實驗組，C6、C6PLXSN細胞為對照組，細胞培養(yǎng)過程中加入5FC終濃度分別為0、01、1、10、100、1000GMOLL，用MTT法測定5FC對各組腫瘤細胞殺傷效應并計算細胞生長抑制率，免疫組化檢測凋亡相關蛋白FAS、FASL及BCL2的表達、流式細胞儀檢測細胞凋亡比例及電鏡觀察等方面來研究腫瘤細胞殺傷情況。結論CDUPRT5FC系統(tǒng)在體外對膠質瘤細胞有明顯的抑制和殺傷作用，其殺傷膠質瘤細胞的機制可能與凋亡有關，而且可能與FAS、FASL及BCL2誘導的凋亡有關。第四部分5FC對裸鼠接種C6CDUPRT腫瘤的治療作用目的觀察CDUPRT5FC基因治療系統(tǒng)對裸鼠皮下膠質瘤的治療效果。方法裸鼠皮下種植C6CDUPRT、C6PLXSN及C6細胞7天后腹腔注射5FC或PBS液，比較裸鼠生存期及腫瘤大小，用流式細胞儀檢測細胞凋亡比例，電鏡觀察細胞形態(tài)變化。結論CDUPRT5FC基因治療方案對裸鼠皮下膠質瘤有明顯的殺傷和抑制作用，CDUPRT5FC對膠質瘤的殺傷作用有凋亡機制的參與。第五部分CDUPRT5FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)對大鼠腦膠質瘤治療作用的實驗研究目的以大鼠顱內腦膠質瘤模型為基礎，觀察CDUPRT5FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)對大鼠腦膠質瘤細胞的殺傷作用，以正確評價CDUPRT5FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)對顱內腦膠質瘤的治療作用。方法應用立體定向技術種植C6CDUPRT細胞至SD大鼠尾狀核，建立顱內膠質瘤荷瘤鼠模型，設立C6PLXSN和C6細胞為對照組，應用5FC腹腔注射治療，觀察腫瘤大小、大鼠生存期、電鏡觀察細胞形態(tài)和流式細胞儀檢測腫瘤細胞的凋亡指標的變化。結論CDIYPRT5FC聯(lián)合基因治療對大鼠顱內腦膠質瘤有明顯的抑制和殺傷作用，其機理與促進細胞凋亡有關。第六部分CDUPRT5FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)藥代動力學及旁觀者效應和作用機理的研究目的在體外和體內水平直接觀察C6CDUPRT細胞內CDLYPRT雙基因表達產物對5FC作用的藥代動力學，并研究CDUPRT5FC基因治療系統(tǒng)的旁觀者效應和相關機理。建立一種無創(chuàng)、動態(tài)、定量的基因治療觀測系統(tǒng)。方法C6和C6CDUPRT細胞株均用含10％FCS小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞附壁后更換培養(yǎng)液，同時加入終濃度為1000ΜMOLL5FC繼續(xù)培養(yǎng)24后終止培養(yǎng)，用核磁共振質譜法MRS測定F的磁共振磁譜FMRS變化，分別檢測細胞培養(yǎng)混合成分、細胞和細胞外培養(yǎng)液中氟化物含量。使用FMRS質子掃描對荷瘤鼠顱內腫瘤進行體內5FC藥代動力學的測定。將C6CDUPRT及未轉染基因的C6細胞按照不同比例混和，C6CDUPRT細胞所占比例分別為0％、10％、25％、50％、75％、100％。用含終濃度為1000GMOLL5FC的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)4天，MTT法檢測OD值計算細胞生長抑制率，進一步計算細胞生存率，繪制細胞生存曲線，進行旁觀者效應的觀察。將C6CDUPRT及未轉染基因的C6細胞按照25％、75％混合細胞接種310細胞于25ML培養(yǎng)瓶，至對數(shù)生長期更換培養(yǎng)液，加入終濃度為1000ΜMOLL5FC培養(yǎng)24小時后收集細胞培養(yǎng)液進行FMRS檢測。結論C6CDUPRT能夠有效表達CD、UPRT酶，高效催化5FC轉化為5FU再進一步代謝為FNUCTD，直接發(fā)揮殺傷膠質瘤細胞的作用。CDUPRT5FC基因治療系統(tǒng)最適用于5FC→5FU→FNUCTD藥代動力學代謝過程的催化作用，兩種自殺基因療法的互補作用，可大大提高其實用價值。轉基因的腫瘤細胞可分泌抗腫瘤活性產物至細胞外，從而抑制和殺傷周圍的腫瘤細胞。表現(xiàn)出明顯的旁觀者效應。FMRS掃描有可能對基因表達的所在部位和產物進行無創(chuàng)、動態(tài)和量化分析，從而對CDUPRT自殺基因治療的療效預測與評估提供客觀指標。

簡介：Y1109206分類號TR743學校代碼103鴕學號2嘲02027福建醫(yī)科大學博士研究生畢業(yè)論文慢病毒載體介導血管生成素一L基匿修飾的骨髓閭一充質干細胞移植治療腦梗死的實驗研究TREATMENTOFCEREBRALINFARCTIONBYTRANSPLANTATIONOFANGIOPOIETINLGENEMODIFIEDMESENEHYMALSTEMCELLSMEDIATEDBYLENTIVIRALVECTOR所在院系研究生S學科專業(yè)導師T研究起止日期附一臨床學院藩桕齡神經病學張志堅教授2005年2月至2007年2月二00七年三月慢病毒載體介導血管生成素1基因修飾的骨髓問充質干細胞移植治療腦梗死的實驗研究中文摘要腦梗死是人類致死的三大疾病之一，其高致殘性給患者、家庭和社會帶來沉重的負擔。長期以來，人們認為中樞神經損傷后引起神經細胞不可逆的死亡，損傷的神經元只能被膠質細胞所填充，形成膠質疤痕，從而喪失了神經功能近年來，骨髓間充質干細胞MESENCHYMALSTEMCELLS，MSCS移植治療腦梗死已成為研究熱點。MSCS作為種子細胞，在體內可囪多種急性損傷后的組織遷移并定位，在局部微環(huán)境的調控下分化為不同的組織細胞。MSCS為組織結構和功能修復提供了細胞來源，且易通過血腦屏障，少有免疫排斥反應，已成為腦缺血性疾病治療的理想靶細胞。血管生成素1ANGIOPOIETIN1，ANG1是一類重要的血管生長因子，特異性地作用于內皮細胞，參與血管生成的調控過程，ANG1通過干預內皮細胞、平滑肌細胞和周細胞之間的相互作用促進血管生成和重塑，在缺血等病理狀態(tài)下可作為一種關鍵的血管生成調節(jié)劑。它可通過促進缺血組織周圍側支循環(huán)形成、穩(wěn)定血管、延緩血管退化；加強內皮細胞間的緊密連結，維持血腦屏障的完整性；保護神經元、抑制凋亡等多重作用機制，從而明顯增加缺血腦組織血流灌注，挽救半賠帶神經元。ANGI已成為缺血性腦血管病基因治療新的靶點。慢病毒載體具有可感染分裂細胞及非分裂細胞、轉移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應等優(yōu)點，已成為當前基因治療中載體研究的熱點。因此。我們設想通過慢病毒載體的介導，將ANG1基因轉移至MSCS中，并將基因修飾的MSCS通過靜脈移植至大腦中動脈栓塞模型大鼠中，利用MSCS可向急性損傷病灶趨化聚集的特點，期待MSCS能夠攜帶4NG1基因遷移至損傷部位，發(fā)揮A皿G1和MSCS的協(xié)同治療作用。本課題分為三部分第一部分血管生成素I基因重組慢病毒載體質粒的構建及鑒定從GENBANK獲得ANGI基因序列，結合載體上的酶切位點需要。設計上下游引物，通過RTPCR方法擴增目的基因片段，通過TA克隆篩選正確的重組體，再通過雙酶切和基因重組構T童_ANG1重組慢病毒載體質粒PNLANGIRES2EGFP，經抗2

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簡介：目的研究趨化因子CXCL10201AG位點基因多態(tài)性與EV71腦炎病情嚴重程度的關系，探討EV71腦炎相關的遺傳易感因素。方法收集2012年7月至2013年7月山東青島地區(qū)EV71感染手足口病病例174例（含普通HFMD103例，腦炎71例），收集同時期同地區(qū)的健康查體兒童共227例，分別提取患兒及健康兒童外周血白細胞的基因組DNA，采用特異性引物聚合酶鏈反應PCRSSP技術檢測EV71手足口病患兒及正常對照組兒童基因組趨化因子CXCL10201AG位點單核苷酸多態(tài)性。結果1CXCL10201AG位點存在三種基因型GG、GA和AA。在174例病例組中GG、GA、AA基因型頻率分別為569％、3448％、862％，在227例對照組中GG、GA、AA基因型頻率分別為5507％、3965％、528％，差異無統(tǒng)計學意義P＞005。病例組中，103例普通HFMD組GG、GA、AA基因型頻率分別為6214％、3398％、388％，71例腦炎組GG、GA、AA基因型頻率分別為5352％、3099％、1549％，差異有統(tǒng)計學意義X27218，P0027。2在174例病例組中G、A等位基因頻率分別為7414％、2586％，在227例對照組中G、A等位基因頻率分別為7489％、2511％，差異無統(tǒng)計學意義P＞005。174例病例組中，103例普通HFMD組G、A等位基因頻率分別為7913％和2087，71例腦炎組G、A等位基因頻率分別為6910％和3099％，差異有統(tǒng)計學意義P0033，相對風險分析發(fā)現(xiàn)攜帶A等位基因的患兒較攜帶G等位基因的患兒腦炎的患病風險增加1702倍1702，95％CI10432776。3記錄174例EV71手足口病患兒的一般情況（包括性別、年齡）、主要臨床表現(xiàn)（包括最高體溫、抽搐、意識障礙、病理征）及輔助檢查（包括血WBC、CRP、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酸激酶同工酶及顱腦MR），并對其基因型和等位基因分布頻率進行比較，發(fā)現(xiàn)在年齡、意識障礙及病理征方面CXCL10201AG位點基因型GG、GA、AA和等位基因A分布頻率差異有統(tǒng)計學意義P＜005實驗室檢查項目中，AA基因型患兒的谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶及血糖指標明顯高于GG和GA基因型患兒P＜005，而在其他指標中的分布頻率未見明顯差異P＞005。4對腦炎組患兒腦脊液檢查結果顯示（指標包括腦脊液葡萄糖、氯化物、蛋白質、腦脊液細胞數(shù)、淋巴細胞計數(shù)及單核細胞比例），并對其中基因型及等位基因分布頻率進行比較，其中，CXCL10201AG位點含有A等位基因的患兒其腦脊液氯化物含量及腦脊液細胞數(shù)比不含A等位基因的患兒的高，但差異不明顯P0086及P006，在葡萄糖、蛋白質、淋巴細胞計數(shù)及單核細胞比例指標的比較中未見明顯差異P＞005。結論CXCL10201AG位點基因多態(tài)性可能與EV71感染后病情嚴重程度有關，攜帶A等位基因可能不會增加EV71患病風險，但EV71引起中樞感染后可能發(fā)展為重癥，可能是EV71腦炎的遺傳易感基因CXCL10201AG位點基因型GG可能為避免感染EV71后發(fā)展為腦炎的保護基因型。

簡介：目的監(jiān)測并分析上海地區(qū)住院和門診腹瀉兒童四種腹瀉病毒的分子流行病學特點，以全面了解及客觀評估腹瀉病毒在兒童腹瀉發(fā)病中的作用，為腹瀉的防治和相關疫苗的開發(fā)應用提供基本數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。方法收集2006年1月至2011年12月在復旦大學附屬兒科醫(yī)院住院的腹瀉兒童（年齡≤5歲）糞便標本674份，并收集2010年7月至2011年12月在復旦大學附屬兒科醫(yī)院門診就診的腹瀉兒童（年齡≤5歲）糞便標本436份。采用RTPCR方法檢測糞便標本中的輪狀病毒（ROTAVIRUS，RV）、杯狀病毒HUMANCALICIVIRUS，HUCV、星狀病毒HUMANASTROVIRUS，HASTV及腺病毒ADENOVIRUS，ADV。采用引物分型的方法確定RV的基因型別，采用基因測序和進化樹分析的方法確定諾如病毒NOVIRUS，NV、札幌病毒（SAPOVIRUS，SAV）、HASTV和ADV的基因型別。采用SPSS160統(tǒng)計分析軟件對研究結果和臨床資料進行統(tǒng)計分析。結果一、20062011年住院腹瀉兒童腹瀉病毒的分子流行病學研究結果如下1腹瀉病毒的總檢出情況四種腹瀉病毒的總檢出率為921％621674，RV、HUCV、HASTV及ADV的總檢出率分別為892％601674、306％206674、301％203674及47％32674。腹瀉兒童單一病毒感染的總檢出率為435％293674，并以RV的單獨感染為主，其他三種病毒單獨感染的總檢出率均＜2％。腹瀉兒童多重病毒感染的總檢出率為486％328674，20062011年病毒混合感染的檢出率呈下降趨勢，2011年降為117％。多重混合感染中，以RVHASTV、RVHUCV及RVHUCVHASTV混合感染的檢出為主。2院內和非院內感染腹瀉兒童腹瀉病毒的檢出院內感染引起腹瀉者占508％302626，以2009年606％和2008年605％最多，2011年降至245％。非院內感染腹瀉者單一病毒的總檢出率478％，147308顯著高于院內感染腹瀉者381％，121318（P＜005），單一病毒的感染均以RV為主。院內感染腹瀉者感染多重腹瀉病毒的總檢出率569％，181318顯著高于非院內感染者429％，132308P＜005，且均以RVHASTV及RVHUCV的混合感染為主。3RV基因型①G基因型雖20062011年G基因型以G3型為主，但G3型的流行呈波動性下降趨勢，由2006年的646％降為2011年的128％，而G9和G1型的流行呈上升趨勢，且G9型511％成為2011年最主要的流行型別，G1型191％為當年的次要流行型別。20062011年G混合基因型所占比例為103％62601，混合的G基因型種類較多，以G1、G3及G9型的兩兩混合為主。②P基因型20062011年P基因型以P4、P8及P混合型的流行為主，而每年P基因型的流行又處于波動性變化中。P混合型以P4P8型為主，其次為P8P10型。③組合型別P8G3型275％是上海地區(qū)20062011年間最主要的RV流行株，其次為PMG3及P4G3型。2011年PGG9型躍升為當年最主要的流行型別405％。院內感染和非院內感染腹瀉兒童中檢出的RV基因型相似。4HUCV基因型檢出的206例HUCV陽性標本均屬NV屬且均為GⅡ型。以GⅡ4型757％，156206為主，其次為GⅡ12型223％，46206。GⅡ4型中以2006B亞型733％，151206的流行為主，同時還分別檢出2例GⅡ7型及GⅡB型。院內感染和非院內感染腹瀉兒童中檢出的HUCV基因型無明顯差異。5HASTV基因型住院腹瀉兒童感染HASTV的基因型別單一，均為HASTV1型。6ADV基因型ADV陽性標本的基因型別以AD41型為主，占500％1632，其次為AD3型250％，832。每年各種基因型的流行又有不同。院內感染和非院內感染腹瀉兒童檢出的ADV基因型無異。二、20102011年門診腹瀉兒童的分子流行病學研究結果如下1總檢出情況四種病毒的總檢出率為667％291436。RV檢出率最高，為433％189436，其次為HUCV294％，128436，ADV71％，31436及HASTV18％，8436。門診腹瀉兒童以單一病毒的感染為主518％，226436，而RV感染的比例最高300％，131436，其次為HUCV160％，72436。腹瀉病毒混合感染的比例為149％65436，混合感染中均為兩種病毒的混合感染，以RVHUCV的雙重感染為主。2RV的流行特點①流行季節(jié)和年齡分布20102011年門診RV性腹瀉以911月份為高峰，10月檢出率最高700％，0～11月齡者497％所占比例最高，963％的患兒年齡在0～3歲之間。②基因型G基因型以G1、G3和G9型的流行為主，檢出率分別為312％、286％和270％。P基因型以P8型為主910％，172189，其次為P4型53％，10189。G混合基因型以G1G9型600％，1220為主。P混合基因型檢出較少26％，主要是P8P4型。P8G3、P8G1和P8G9型是主要流行的三種組合型別，所占比例分別為275％52189、269％51189和254％48189。3HUCV的流行特點①流行季節(jié)和年齡分布910月為門診腹瀉兒童HUCV性腹瀉的流行高峰，9月份667％的檢出率最高，6月的檢出率也高達600％，0～11月齡者最多567％，72128，976％的腹瀉患兒在0～3歲之間。②HUCV基因型檢出的128例HUCV陽性標本中，126例屬NV屬，2例為SAV屬。所有NV株均為GⅡ型，并以GⅡ4型718％，92126為主，其次為GⅡB型156％，20126，尚檢出少量GⅡ12、GⅡ7及GⅡ2型。GⅡ4型中以2006B亞型656％為主，同時檢出8例2006A亞型。檢出的2例SAV分別是GⅠ2型及GⅡ1型。4HASTV基因型門診腹瀉兒童HASTV陽性者型別均為HASTV1型。5ADV基因型以AD41型為主452％，1431，其次為AD3型226％，731及AD40型161％，531。此外還檢出2例AD12型及各1例AD2、5及19型。結論上海地區(qū)無論是住院還是門診引起兒童腹瀉的主要病毒均為輪狀病毒和諾如病毒。相比以往上海地區(qū)的監(jiān)測資料，輪狀病毒和諾如病毒的流行型別又出現(xiàn)了新的變化。院內感染與非院內感染腹瀉患兒的臨床癥狀、多重感染比例均存在差異，但各病毒流行的主要基因型別相似。門診腹瀉兒童腺病毒的檢出率高于住院腹瀉兒童。住院與門診腹瀉兒童杯狀病毒、腺病毒的流行型別存在一定的差異。