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簡(jiǎn)介：第一軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文通用型四環(huán)素調(diào)控腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及其治療帕金森病的應(yīng)用研究姓名牛東濱申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師舒斯云200151THECONSTRUCTIONOFGENERALTETRACYCLINEREGULATABLEADENOASSOCIATEDVIRUSVECTORSANDTHESTUDYOFITSAPPLICATIONINGENETICTHERAPYOFPARKINSON’SDISEASEPHDCANDIDATENIUDONGBINTUTORPROFESSOFSHUSIYRU“ⅢEUROSCIENCERESEARCHINSTITUTE，1“MILITARYMEDICALUNIVERSITYABSTRACTPARKINSON’DISEASEISANEURODEGENRATIVEDISEASECHARACTERISEDBYRESTINGTREMORRIGIDITYBRADYKINESIATRADITIONALLYPDISTREATEDBYORALADMINISTRATIONOFLDOPAWITHTIME，THETHERAPEUTICEFFECTOFLDOPADECREASEDRAMATICALLYANDPDPATIENTSBECOMEINTOLERABLETOITSADVERSEEFFCETSNOWGENETHERAPYISAPOTENTIALLYPOWERFULAPPROACHTOTHETREATMENTOFPARKINSON’SDISEASEFORTHIS，BASEDONTHETETRACYCLINEREGULATORYSYSTEM，WEHAVECONSTRUCTEDTWOGENERALTETRACYCLINEREGULATABLEADENOASSOCIATEDVIRUSVECTORSWHICHDIFFERENTEACHOTHERTHEFUNCTIONOFTHISVECTORS，INWHICHCARRIEDAREPORTERGENE，GFPOREGFPWEREEVALUATEDFOLLOWINGTRANSFERINTOCELLLINE，ANDTHECONDITIONALEXPRESSIONOFTHGENEWASINVESTIGATEDINVITROBYADMINISTRATIONOFDOXYCYCLINETHEMAINRESULTSAREASFOLLOWING1USINGATETRACYCLINEREPRESSIBLECONSTRUCT，TWODIFFERENTGENERALTETRACYCLINEREGULATABLEADENOASSOCIATEDRIMSVECTORPLASMIDSWERECONSTRUCTEDTOATLEASTPROVIDEASOPERATIVELYLINKEDCOMPONENTSINTHEDIRECTIONOFTRANSCRIPTION，NAMEDPSVTTAANDPSVBITTARESPECTIVELYPLASMIDPSVTTACONTAINSTHEFOLLOWINGDNASEQUENCESOPERATIVELYLINKEDFROM5’TO3’POLYADENYLATIONSIGNAL，MULTIPLECLONINGSITE，THEHUMANCYTOMEGALOVIRUSPROMOTER1ECOMBINEDWITHTETOPERATORSEQUENCES，ANDTHETETRACYCLINERESPONSIVETRANSCRIPTIONALACTIVATORTTAEXPRESSIONCODON，ALLTHISELEMENTAREPLACEEDINBETWEENTWO1TRANOTHERPLASMIDPSVBITTAISAAUTOREGULATEDBIDIRECTIONALEXPRESSIONVECTORINWHICHTHECONDITIONEXPRESSIONOFTWOGENES，THEINTERESTEDGENEANDTTA，CANBETIGHTLYREGULATED，ITISALSOAPOSITIVEFEEDBACKREGULATORYSYSTEMTHEVECTORCOMPRISINGNEOMYCINANDKANAMYCINRESISTANCECASSETTE，ANDCANBEUSEDTOTRANSFERGENEINMAMMALIANCELL2

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簡(jiǎn)介：目的建立復(fù)合因素所致的認(rèn)知功能障礙動(dòng)物模型并探討其行為學(xué)、病理形態(tài)、細(xì)胞凋亡、血液流變學(xué)、血脂、氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)各方面指標(biāo)的互聯(lián)關(guān)系及動(dòng)態(tài)變化同時(shí)觀察還腦益聰方對(duì)上述指標(biāo)的影響闡釋還腦益聰方的作用機(jī)理和途徑為臨床治療認(rèn)知功能障礙提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法本研究共分為兩部分。第一部分將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為6周模型組、6周空白組、8周模型組、8周空白組；采用皮下注射D半乳糖及飼喂半高脂飼料的造模方法建立認(rèn)知功能障礙動(dòng)物模型分別于第6周末及第8周末檢測(cè)如下指標(biāo)MRIS水迷宮及物體識(shí)別試驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；HE染色后光鏡觀察海馬形態(tài)學(xué)變化；電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)變化；TUNEL法檢測(cè)海馬凋亡細(xì)胞數(shù)量；免疫組化法分析海馬抑制凋亡基因BCL2和促進(jìn)凋亡基因BAX的表達(dá)及其比值；試劑盒檢測(cè)血漿P選擇素和PAI1含量；檢測(cè)血液黏度、血小板聚集性、紅細(xì)胞變形性及血清TC、TG、LDLC、HDIC的水平；放免法檢測(cè)海馬勻漿TNFΑ、IL6的含量；試劑盒檢測(cè)海馬勻漿MDA、GSHPX、GSHST、OXLDL的含量。觀察大鼠行為學(xué)、病理形態(tài)、細(xì)胞凋亡、血液流變學(xué)、血脂、氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)各方面指標(biāo)的變化。第二部分將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為中藥高劑量組、中藥低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、模型對(duì)照組、空白對(duì)照組按上法建立動(dòng)物模型于第6周末時(shí)采用還腦益聰方進(jìn)行治療繼4周后對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)以觀察還腦益聰方對(duì)認(rèn)知功能障礙大鼠各指標(biāo)的影響。結(jié)果第一部分1定位航行試驗(yàn)中6周模型組逃避潛伏期較空白組延長(zhǎng)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005；8周模型組逃避潛伏期較空白組明顯延長(zhǎng)P005；8周模型組穿臺(tái)次數(shù)較8周空白組明顯減少P2物體識(shí)別試驗(yàn)中6周、8周動(dòng)物的分辨指數(shù)明顯降低和空白組比較有顯著差異P005。3HE染色后光鏡下觀察模型組大鼠海馬病理形態(tài)顯示神經(jīng)元數(shù)量減少突起明顯稀疏8周模型組與6周模型組比較有加重；電鏡下觀察模型大鼠海馬細(xì)胞核萎縮染色質(zhì)呈邊集現(xiàn)象線粒體萎縮8周模型組結(jié)構(gòu)變化差于6周模型組。46周、8周模型組凋亡細(xì)胞明顯增多和空白組比較有顯著性差異P005；6、8周模型組BCL2與BAX的比值明顯減少與空白組比較有顯著差異P56周、8周模型組P選擇素含量明顯升高和空白組比較有顯著差異P005。6周模型組PAI1含量與6周空白組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005；8周模型組PAI1含量升高和8周空白組比較有顯著性差異P005。66周、8周模型組的血液黏度明顯升高和空白組相比有顯著差異P005。6周和8周模型組血小板聚集指數(shù)較空白組升高P005。6周模型組血小板最大聚集數(shù)和6周空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005；8周模型組血小板最大聚集數(shù)較8周空白組增加P005。6周、8周模型組的紅細(xì)胞聚集指數(shù)明顯升高和空白組相比有顯著差異P005；6周、8周模型組的纖維蛋白原含量也明顯升高和空白組比較差異顯著P005。76周模型組的TC、TG、LDLC水平明顯升高與空白組比較有顯著差異P005；8周模型組TC水平明顯升高與空白組比較有顯著差異P86周、8周模型組大鼠海馬組織的OXLDL、TNFΑ、IL6水平顯著升高與空白組比較差異顯著P005。第二部分1定位航行試驗(yàn)中還腦益聰方可改善認(rèn)知功能障礙大鼠學(xué)習(xí)記憶功能但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P005?？臻g探索試驗(yàn)中還腦益聰方及多奈哌齊均可改善模型大鼠記憶功能陽(yáng)性組及中藥高劑量組經(jīng)過(guò)原平臺(tái)的次數(shù)較模型組增加統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異顯著P2物體識(shí)別試驗(yàn)中多奈哌齊可改善模型大鼠記憶功能提高分辨指數(shù)與模型組相比有顯著差異P005。3HE染色后光鏡下觀察模型組大鼠海馬區(qū)錐體神經(jīng)細(xì)胞核增大胞漿染色減弱少部分核變少核膜皺縮染色質(zhì)密集膠質(zhì)細(xì)胞增多；陽(yáng)性組較模型組有所好轉(zhuǎn)；還腦益聰方低、高劑量組的病變明顯減輕。電鏡下海馬超微結(jié)構(gòu)顯示模型組大鼠海馬細(xì)胞核明顯變小核膜皺縮且增厚核周出現(xiàn)空暈線粒體萎縮；陽(yáng)性組較模型組病變輕；還腦益聰方低、高劑量組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞腫脹基質(zhì)密度不均勻細(xì)胞器病變有所減輕。4高、低劑量的還腦益聰方及多奈哌齊均可減少海馬細(xì)胞凋亡數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005。高、低劑量的還腦益聰方及多奈哌齊均可下調(diào)凋亡促進(jìn)基因BAX的表達(dá)但與模型組比較差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005。高、低劑量的還腦益聰方均可提高BC12與BAX的比值P5高、低劑量的還腦益聰方及多奈哌齊均可顯著降低認(rèn)知功能障礙大鼠血清P選擇素含量P6高、低劑量的還腦益聰方及多奈哌齊均可降低5S1、10S1、35S1剪切率下的血液黏度P005。高、低劑量的還腦益聰方均可顯著降低認(rèn)知功能障礙大鼠的紅細(xì)胞聚集指數(shù)及血漿纖維蛋白原含量P005。7高、低劑量的還腦益聰方均對(duì)大鼠TG水平有降低作用和模型組比較有顯著差異P005。8高劑量的還腦益聰方能顯著降低大鼠大腦OXLDL含量與模型組比較有顯著差異P005多奈哌齊能明顯降低大鼠大腦IL6的含量與模型組相比有顯著差異P005。高、低劑量還腦益聰方及多奈哌齊均可降低大鼠GSHPX及GSHST含量但差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005。結(jié)論1注射D半乳糖合并半高脂飼料復(fù)制的認(rèn)知功能障礙模型更接近于認(rèn)知功能障礙的病變過(guò)程符合臨床病理特征。2還腦益聰方可改善認(rèn)知功能障礙模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。3還腦益聰方可改善認(rèn)知功能障礙模型大鼠病理學(xué)、細(xì)胞凋亡、血液流變學(xué)、血脂及氧化應(yīng)激與炎癥介質(zhì)各方面指標(biāo)這可能是其主要的療效機(jī)制和作用途徑。

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簡(jiǎn)介：目的利用GEXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)，建立一種能夠同時(shí)檢測(cè)腦炎相關(guān)的8種蟲媒病毒的多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)MRTPCR方法，并對(duì)此方法作出初步評(píng)價(jià)。方法以腦炎相關(guān)的8種蟲媒病毒為研究對(duì)象，包括版納病毒BANNAVIRUS，BAV，乙型腦炎病毒JAPANESEENCEPHALITISVIRUS，JEV，蜱傳腦炎病毒TICKBNEENCEPHALITISVIRUS，TBEV，TAHYNA病毒TAHYNAVIRUS，TAHV，遼寧病毒LIAONINGVIRUS，LNV，科薩努爾森林病病毒KYASANURFESTDISEASEVIRUS，KFDV，辛德畢斯病毒SINDBISVIRUS，SINV及云南環(huán)狀病毒YUNNANBIVIRUS，YUOV并加入小鼠腦脊髓炎病毒THEILERSMOUSEENCEPHALOMYELITISVIRUS，TMEV做為內(nèi)部對(duì)照。利用GEXP系統(tǒng)建立多重RTPCR檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)各病毒特異引物并進(jìn)行篩選，以病毒分離培養(yǎng)物和陽(yáng)性標(biāo)本來(lái)驗(yàn)證引物及多重反應(yīng)體系的特異性，根據(jù)PCR結(jié)果來(lái)優(yōu)化多重反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，構(gòu)建單克隆質(zhì)粒并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄并制備標(biāo)準(zhǔn)品即體外轉(zhuǎn)錄RNA的梯度稀釋液來(lái)檢測(cè)多重體系的靈敏度。用該方法對(duì)未知標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果與其它方法進(jìn)行比較，根據(jù)比較的結(jié)果對(duì)該方法做出評(píng)價(jià)。結(jié)果篩選后的各病毒引物擴(kuò)增片段大小與設(shè)計(jì)相符且特異性強(qiáng)，相互之間無(wú)交叉反應(yīng)。優(yōu)化后的多重檢測(cè)體系，可擴(kuò)增出各病毒對(duì)應(yīng)的特異片段，可在102拷貝ΜL水平同時(shí)并特異地檢測(cè)出8種（共13個(gè)特異片段）腦炎相關(guān)蟲媒病毒RNA。通過(guò)對(duì)37份蚊蟲碾磨液提取核酸的標(biāo)本檢測(cè)，可看出GEXP多重檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，且靈敏度明顯高于病毒分離及半巢式PCR。結(jié)論成功建立了一種基于GEXP的多重RTPCR技術(shù)平臺(tái)的8種腦炎相關(guān)蟲媒病毒的檢測(cè)新方法，該方法具有高通量、靈敏度高、特異性強(qiáng)且快速等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)病毒性腦炎的分子診斷及流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

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簡(jiǎn)介：諾如病毒NOV是全球范圍內(nèi)引起成人和兒童非菌性急性胃腸炎暴發(fā)流行的重要病原體同時(shí)也是嬰幼兒散發(fā)性胃腸炎的常見(jiàn)病原僅次于輪狀病毒無(wú)論發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家NOV都有很高的感染率。美國(guó)疾病控制中心CDC曾經(jīng)估計(jì)美國(guó)每年有至少2300萬(wàn)例NOV導(dǎo)致的胃腸炎病例約占其人口總數(shù)的10％占到所有已知病原體導(dǎo)致疾病總數(shù)的60％有超過(guò)73％到95％的傳染性胃腸炎暴發(fā)是由NOV造成的每年因NOV胃腸炎的治療費(fèi)用和間接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)35至75億美元。據(jù)前些年統(tǒng)計(jì)在我國(guó)腹瀉病是位居第二位的對(duì)小兒威脅較大的常見(jiàn)多發(fā)病其中病毒性腹瀉占40％以上由NOV引起的腹瀉估計(jì)占13。實(shí)際上過(guò)去由于未列入常規(guī)檢測(cè)或報(bào)告項(xiàng)目對(duì)該病毒感染和發(fā)病的的危害仍被嚴(yán)重低估。NOV基因組屬于單股正鏈RNA全長(zhǎng)約75～77KB包括3個(gè)開放閱讀框FSF2編碼的含540個(gè)氨基酸的主要衣殼蛋白VP1為NOV抗原主要決定簇同時(shí)負(fù)責(zé)識(shí)別結(jié)合受體近年來(lái)已成為NOV的主要研究對(duì)象。NOV具有高度遺傳多樣性不同國(guó)家、社區(qū)同時(shí)可能存在不同的NOV毒株流行。自20世紀(jì)90年代中期首次確認(rèn)GⅡ4型NOV毒株導(dǎo)致絕大部分NOV胃腸炎暴發(fā)和世界性大流行后NOVGⅡ4型毒株一直為為全球優(yōu)勢(shì)流行株。我們課題組南方醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院流行病學(xué)系自2002年以來(lái)對(duì)廣東省多地NOV感染進(jìn)行了前瞻性流行病學(xué)研究結(jié)果表明NOVGⅡ4型為主要流行株占到總數(shù)的829％該結(jié)果得到了北京、長(zhǎng)春、濟(jì)南、蘭州、福州等地NOV研究的證實(shí)。由于缺乏細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)亦無(wú)合適的動(dòng)物感染模型一直以來(lái)抗NOV胃腸炎的藥物研究進(jìn)展緩慢迄今為止尚缺乏針對(duì)NOV胃腸炎的有效抗病毒藥物和疫苗。近年來(lái)隨著國(guó)外學(xué)者對(duì)NOV基因組結(jié)構(gòu)和發(fā)病機(jī)制研究的日益深入發(fā)現(xiàn)了一些具有前景的抗NOV藥物靶標(biāo)如通過(guò)多糖受體阻斷病毒與宿主細(xì)胞相互作用、抑制病毒蛋白水解酶和多聚酶作用和抑制病毒復(fù)制等方面。這些進(jìn)展為抗NOV性胃腸炎的藥物研究提供了新思路。本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上以我國(guó)NOV流行優(yōu)勢(shì)株GⅡ4型毒株為主要研究對(duì)象以NOV入侵人體的主要致病蛋白VP1及其所識(shí)別的人類組織血型抗原HBGAS受體為研究切入點(diǎn)克隆GⅡ4型NOVF2基因利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)BACTOBAC表達(dá)純化GⅡ4型病毒樣顆粒VLP在此基礎(chǔ)上采用凝集抑制實(shí)驗(yàn)法測(cè)定唾液HBGAS受體分型A、B、H建立一種體外NOVVLPS結(jié)合唾液HBGAS受體的酶聯(lián)免疫EIA藥物篩選模型。中醫(yī)藥治療病毒性腹瀉歷史悠久、經(jīng)驗(yàn)豐富、療效肯定且自成體系。近年來(lái)中醫(yī)藥界為尋求有效的療法進(jìn)行了多方探索各地涌現(xiàn)出大量自擬新方經(jīng)臨床和實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的開發(fā)前景。本研究通過(guò)收集中醫(yī)藥治療病毒性腹瀉的現(xiàn)代有關(guān)文獻(xiàn)試圖通過(guò)對(duì)病毒性腹瀉有效方劑之基本結(jié)構(gòu)和核心藥物的深入分析篩選出具有研究前景的候選藥物并擬定更加合理和可行的中醫(yī)治療方案以期為利用此模型進(jìn)行針對(duì)性的高通量抗NOV中藥化合物篩選奠定文獻(xiàn)基礎(chǔ)。一、GⅡ4型諾如病毒F2基因的克隆與序列分析從三株GⅡ4型NOV糞便中GZ55GZ121JM482提取病毒RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后以CDNA為模板PCR擴(kuò)增出完整F2基因分別與PMD18T載體連接得到重組質(zhì)粒PMD18TGZ55F2PMD18TGZ121F2PMD18TJM482F2。DNA測(cè)序后進(jìn)行全部核苷酸、氨基酸序列分析比較和進(jìn)化樹分析。結(jié)果表明根據(jù)GENBANK公布的GⅡ4型NOV保守序列設(shè)計(jì)合成特異性引物3株GZ55GZ121JM482NOV糞便標(biāo)本通過(guò)RTPCR均得到約17KB分子量大小F2區(qū)域片斷其長(zhǎng)度與預(yù)計(jì)相符。重組質(zhì)粒行BAMHⅠ和HINDⅢ雙酶切后PCR擴(kuò)增出完整F2閱讀框序列約162KB。利用DNASTAR軟件分析該3株NOVF2序列其中GZ55、GZ121F2共1620個(gè)堿基編碼539個(gè)氨基酸JM482F2共1623個(gè)堿基編碼540個(gè)氨基酸。GZ55、GZ121和JM482與VA387氨基酸同源性分別為92％、93％、93％。經(jīng)與GENBANK代表性NOVGⅠGⅡ的F2氨基酸比較分析結(jié)果表明NOVF2包括2個(gè)主要區(qū)域N端結(jié)尾的殼區(qū)域S區(qū)域和C端結(jié)尾的突出區(qū)域P區(qū)域；其編碼的氨基酸序列存在3個(gè)相對(duì)保守序列S區(qū)與P區(qū)結(jié)合部位的FLVPPTVE序列、P1亞區(qū)KT或RT氨基酸序列、P區(qū)域C末端保守精氨酸R簇。結(jié)合文獻(xiàn)分析這些保守序列均具有不同的重要作用含F(xiàn)LVPPTVE鉸鏈的P二聚體和HBGAS受體結(jié)合力低而不含鉸鏈的P顆粒結(jié)合HBGAS受體能力非常強(qiáng)；P1亞區(qū)KT或RT氨基酸序列為胰島素酶切位點(diǎn)；C末端保守精氨酸R簇在識(shí)別受體過(guò)程是必需的。二、F2基因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)形成病毒樣顆粒的研究用限制性內(nèi)切酶BAMHⅠ和HINDⅢ將質(zhì)粒PMD18TGZ121F2酶切回收酶切的目的基因F2片段再與用BAMHⅠ和HINDⅢ酶切的線性化載體PFASTBACTM1連接獲得重組轉(zhuǎn)座載體PFASTBACGZ121F2將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10BAC得到重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒RBACGZ121F2經(jīng)用瓊脂糖凝膠電泳和PCR鑒定后將其轉(zhuǎn)染昆蟲SF9細(xì)胞從培養(yǎng)上清中獲得重組桿狀病毒RBACGZ121F2以之重新感染新鮮的SF9細(xì)胞表達(dá)外源蛋白。對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行SDSPAGE和WESTERNBLOT分析發(fā)現(xiàn)重組病毒RBACGZ121F2表達(dá)了分子量約為58KDA的NOV衣殼蛋白大小與VLP相符說(shuō)明桿狀病毒攜帶的NOV衣殼蛋白基因F2在昆蟲細(xì)胞中得到成功表達(dá)。對(duì)細(xì)胞上清采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心純化出VLP并經(jīng)負(fù)染電鏡得到證實(shí)其直徑約為30NM形態(tài)和結(jié)構(gòu)與野生型NOV相同。為進(jìn)一步研究VLP的各種特性打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。三、病毒樣顆粒結(jié)合唾液HBGAS受體的檢測(cè)及意義收集健康志愿者唾液標(biāo)本采用凝集抑制實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)唾液中HBGAS血型物質(zhì)用EIA法檢測(cè)NOVVLP與HBGAS的結(jié)合特性。結(jié)果顯示63份唾液標(biāo)本檢出O型21例占333％B型14例占222％A型和非分泌型各13例分別占206％AB型2例占32％。NOVVLP與A、B、O型均能結(jié)合OD值25與非分泌型唾液不結(jié)合OD值～03結(jié)合方式與RVA387相一致其與受體結(jié)合的特異性也再次表明我們成功在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)了VLP。針對(duì)NOV結(jié)構(gòu)蛋白VP1的HBGAS受體阻斷劑的篩選和開發(fā)具有更為廣闊的研究前景和現(xiàn)實(shí)意義。本研究建立的NOVVLP和HBGAS受體結(jié)合模型重復(fù)性好且具有快速經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)為開發(fā)我國(guó)人群NOV暴發(fā)的防治藥物提供了理想篩選模型。四、中醫(yī)藥抗病毒性腹瀉有效方藥的篩選和評(píng)價(jià)以中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)光盤數(shù)據(jù)庫(kù)CBMDISC和中國(guó)學(xué)術(shù)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)CNKI1999年1月2008年12月所收集的文獻(xiàn)為資料范圍以病毒性腹瀉秋季腹瀉急性胃腸炎中醫(yī)中藥中成藥中西醫(yī)結(jié)合經(jīng)驗(yàn)報(bào)道為計(jì)算機(jī)檢索式從文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到文獻(xiàn)374篇進(jìn)一步評(píng)定與篩選剔除不合格文獻(xiàn)最終收集到符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的合格文獻(xiàn)158篇每篇文獻(xiàn)中關(guān)于中藥組方的描述均作為一條記錄。通過(guò)對(duì)組方的用藥頻次處理發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥抗病毒性腹瀉的處方用藥主要有如下特點(diǎn)1重視經(jīng)典方劑的運(yùn)用明確提到以經(jīng)典方劑傳統(tǒng)成方加味治療的文獻(xiàn)47篇占總數(shù)的341％。核心方劑是五苓散、葛根芩連湯、瀉心湯、藿香正氣散、理中湯和七味白術(shù)散。2用藥集中主要集中在云苓、白術(shù)、葛根、藿香、蒼術(shù)、黃芩、車前子等31味核心藥物占藥物出現(xiàn)總頻次的785％。藥物類別主要集中在補(bǔ)虛藥、利水滲濕藥和化濕藥等十大類。3健脾滲濕并重補(bǔ)虛藥用藥頻次最多且主要集中在健脾益氣藥白術(shù)、黨參、山藥、扁豆；利水滲濕藥僅居其次集中在云苓、車前子、澤瀉、豬苓、薏苡仁?！耙苑綔y(cè)證”可見(jiàn)脾虛濕盛是病毒性腹瀉的主要病機(jī)。4兼顧病因加減化裁忌閉門留寇除注重健脾滲濕外化濕藥、清熱藥、消食藥、解表藥、溫里藥比重相對(duì)平均證明致泄病因主要集中在濕、熱、食滯、寒幾類。臨床根據(jù)兼夾不同可隨證加減或清化濕熱、或溫化寒濕、或疏表、或消導(dǎo)。收澀藥出現(xiàn)頻次僅居第八位表明多數(shù)醫(yī)家不主張?bào)E用補(bǔ)澀以防閉門留寇。通過(guò)對(duì)治療病毒性腹瀉有效方藥的篩選和分析特?cái)M定優(yōu)化組方用藥方案如下炒白術(shù)10G、云苓10G、藿香10G、煨葛根10G、車前子10G、烏梅5G。

簡(jiǎn)介：【目的】建立VMC模型后72H給藥，評(píng)價(jià)OC和CA對(duì)小鼠VMC的治療作用，探討OC治療VMC的活性成分與作用機(jī)制，為新藥開發(fā)提供依據(jù)。【方法】1CA與OCLD50的測(cè)定；2復(fù)制VMC模型；3OC對(duì)小鼠VMC的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)；4CA對(duì)小鼠VMC的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)；【結(jié)論】1CA與OC的LD50分別為2350MGKG、2816MGKG；21091010PFULIP01ML能成功復(fù)制小鼠VMC模型。建模后72H給藥的方法能評(píng)價(jià)藥物治療VMC的作用；3OC與CA具有治療小鼠VMC的作用，初步證實(shí)CA為OC治療VMC的有效成分，其作用機(jī)制可能與抑制體內(nèi)INOS表達(dá)有關(guān)；4CA有望開發(fā)為VMC的治療用藥。

簡(jiǎn)介：華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知機(jī)制及干預(yù)性研究姓名金一波申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)基礎(chǔ)心理學(xué)指導(dǎo)教師楊治良20080401摘要抑郁是人類心理失調(diào)最主要和最經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題之一，是每個(gè)個(gè)體在其生命歷程中或多或少都會(huì)感受到的一種情緒。而關(guān)于抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知，也成為心理學(xué)研究者所關(guān)注的重要課題。目前對(duì)該問(wèn)題的實(shí)驗(yàn)研究主要有兩種方法，一是情緒STROOP范式，另一種是遮蔽技術(shù)。關(guān)于抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知的理論闡釋，影響最大的莫過(guò)于BECK的抑郁認(rèn)知模型。該理論認(rèn)為，個(gè)體對(duì)事物錯(cuò)誤、歪曲的認(rèn)知觀念導(dǎo)致了抑郁的出現(xiàn)。首先，認(rèn)知易感性表現(xiàn)為一些功能失調(diào)觀念；其次，功能失調(diào)觀念導(dǎo)致或啟動(dòng)個(gè)體潛在的自我消極圖式，對(duì)事物進(jìn)行消極的、歪曲的認(rèn)知。這種消極的自我圖式，體現(xiàn)了一種歪曲的信息加工方式，是一種易感因素，會(huì)最終導(dǎo)致臨床軀體障礙、動(dòng)力減退、情緒低落等抑郁癥狀。這些癥狀反過(guò)來(lái)又導(dǎo)致消極觀念增多，二者形成惡性循環(huán)，并呈不斷惡化的趨勢(shì)。抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知的已有的研究主要沿著兩條思路展開一是關(guān)于抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知影響因素的研究，～是有關(guān)抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知調(diào)節(jié)策略的采用。前者主要關(guān)注影響抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知的外部和內(nèi)部因素，而后者則主要涉及干預(yù)情緒認(rèn)知策略的探索。盡管研究者進(jìn)行了比較廣泛的探討，但是有關(guān)抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知機(jī)制的研究尚未涉及，并且在探索抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知的調(diào)節(jié)策略中也存在困惑，結(jié)果不盡一致，需要進(jìn)一步論證。因此，為了進(jìn)一步研究抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知的機(jī)制以及干預(yù)策略，本文分四個(gè)研究七個(gè)實(shí)驗(yàn)展開探索，論文研究的整體框架如下第一部分為文獻(xiàn)資料綜述，系統(tǒng)回顧了抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知研究的歷史與現(xiàn)狀，闡釋了主要理論及有代表性的思想，在此基礎(chǔ)上指出了抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知研究存在的問(wèn)題，并針對(duì)該問(wèn)題提出了自己的研究設(shè)想與理論假設(shè)。第二部分為實(shí)驗(yàn)研究，共包括四個(gè)研究七個(gè)實(shí)驗(yàn)。主要探討了以下幾個(gè)問(wèn)題首先研究了抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知的特點(diǎn)，結(jié)果表明抑郁個(gè)體傾向于對(duì)負(fù)性情緒刺激的加工，并且抑郁個(gè)體的認(rèn)知圖式影響對(duì)情緒刺激的加工；發(fā)現(xiàn)在抑郁個(gè)體認(rèn)知加工過(guò)程中，執(zhí)行和抑制功能都在起作用。其次，探討了抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知的機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知的機(jī)制應(yīng)該是自動(dòng)提取的過(guò)程，或者是無(wú)意識(shí)提取的過(guò)程。再次，探索抑郁個(gè)體情緒認(rèn)知的腦機(jī)制，結(jié)果表明，抑郁組與正常組在識(shí)別情緒詞語(yǔ)中的ERP成分具有顯著性的差異，尤其是抑郁組的P490波幅低7

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多流感病毒血凝素抑制肽結(jié)構(gòu)修飾與活性評(píng)價(jià).pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：目的慢性阻塞性肺疾?。–HRONICOBSTRUCTIVEPULMONARYDISEASECOPD）的病因很復(fù)雜其發(fā)病機(jī)制尚不清楚呼吸道感染現(xiàn)已被認(rèn)為是誘發(fā)COPD急性加重的重要因素尤其病毒感染可能影響著COPD的發(fā)生與發(fā)展但感染與COPD發(fā)病機(jī)制之間的因果關(guān)系尚未被證實(shí)而且一直是個(gè)有爭(zhēng)議的問(wèn)題我們的研究通過(guò)檢測(cè)血清中的病毒特異性抗體IGM、IGG了解COPD患者的病毒感染情況及觀察T淋巴細(xì)胞亞群的變化病毒感染與COPD急性加重的關(guān)系探討病毒感染在COPD病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制中的作用結(jié)論1、病毒感染是COPD急性加重期的重要誘因2、病毒感染與COPD發(fā)病具有相關(guān)性病毒感染可能參與了COPD的發(fā)病機(jī)制3、近期病毒感染后CD和CD細(xì)胞數(shù)量降低、CD數(shù)量增多說(shuō)明病毒感染可嚴(yán)重影響機(jī)體的免疫系統(tǒng)導(dǎo)致機(jī)體的免疫紊亂進(jìn)一步破壞了COPD患者的免疫功能

簡(jiǎn)介：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院）博士學(xué)位論文慢病毒介導(dǎo)NT3基因轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)生物學(xué)特性研究姓名李立君申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師王任直20080601中文摘要研究背景和目的神經(jīng)干細(xì)胞NEURALSTEMCELLS，NSCS移植和基因治療，是治療缺血性腦血管疾病的兩個(gè)重要的研究途徑。近年來(lái)，神經(jīng)干細(xì)胞已經(jīng)被用作基因治療的載體，可將治療基因攜帶到病灶，通過(guò)治療基因在缺血性損傷局部表達(dá)而發(fā)揮作用，有望為中風(fēng)的治療帶來(lái)新的希望。本研究的目的以慢病毒LCNTIVIMS，LV介導(dǎo)，將HNR3基因轉(zhuǎn)入NSCS，并進(jìn)行體外培養(yǎng)，探討NSCSHNT3在體外分化以及表達(dá)NT3時(shí)間上的特點(diǎn)，為體內(nèi)移植NSCSHNT3的研究和臨床應(yīng)用提供必要的體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法實(shí)驗(yàn)共分二部分。第一部分從孕14天SPRAGUCDAWLEYSD大鼠胚胎的腦組織分離出神經(jīng)干細(xì)胞，采用無(wú)血清培養(yǎng)法，進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，并通過(guò)免疫熒光化學(xué)染色巢蛋白進(jìn)行鑒定。取傳至第5～6代神經(jīng)干細(xì)胞，以L105CELLS／5001D／孔接種于24孔板，分別按復(fù)感染指數(shù)MULTIPLICITIESOFINFECTIONMOIS值為0、L、5、10、15、20加入攜帶報(bào)告基因GFP的慢病毒載體1ENTIVIRALVEETORGFP，【MGFP稀釋液，每一滴度加六孔，共六組。2“3天后于倒置熒光顯微鏡下觀察各組GFP的表達(dá)效率，并在3天后進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞球進(jìn)行計(jì)數(shù)，觀察LV／GFP對(duì)NSCS增殖的影響。并行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，得出各組NSCS的GFP陽(yáng)性轉(zhuǎn)染率。第二部分構(gòu)建表達(dá)HNT3基因的慢病毒載體1ENTIVIRALVE髟TORHNT3，LV／HNT3，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)最佳MOI用LV／心爪3轉(zhuǎn)染NSCS，對(duì)照組NSCS不轉(zhuǎn)染病毒。兩組細(xì)胞繼續(xù)無(wú)血清培養(yǎng)，48H“96H后，應(yīng)用ELISA和免疫熒光染色方法對(duì)兩組NSCS在體外的分化和NT3的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果第一部分NSCS以懸浮細(xì)胞球方式生長(zhǎng)，NESTIN染色陽(yáng)性。轉(zhuǎn)染GFP基因后，除M01值為0的對(duì)照組外，23天后各孔均有GFP表達(dá)。MOI值從0增至10，細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸提高P85％的轉(zhuǎn)染率。但MOI值從10增至20，形成的神經(jīng)干細(xì)胞球數(shù)目卻逐漸減少。第二部分NT3修飾的神經(jīng)干細(xì)胞早期跟親代無(wú)形態(tài)學(xué)區(qū)別，34天后，實(shí)驗(yàn)組中神經(jīng)干細(xì)胞分化比例比對(duì)照組明顯要高，已分化的細(xì)胞在形態(tài)上與對(duì)照組比較細(xì)胞突起長(zhǎng)而且數(shù)

簡(jiǎn)介：目的通過(guò)研究電針對(duì)切除卵巢大鼠行為學(xué)及海馬區(qū)相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的影響，以探討電針治療低雌激素性認(rèn)知功能障礙的可能機(jī)制。方法雌性SD大鼠40只隨機(jī)分為假手術(shù)組（切除卵巢周圍脂肪），模型組（去卵巢），假電針組（去卵巢后假電針刺激），電針組（去卵巢后電針刺激），每組10只。采用卵巢切除大鼠模型，造成大鼠低雌激素記憶障礙，去勢(shì)2周后進(jìn)行電針刺激，連續(xù)治療3個(gè)月。MRIS水迷宮測(cè)試空間學(xué)習(xí)記憶能力，酶聯(lián)免疫吸附分析ENZYMELINKEDIMMUNOSBENTASSAYELISA檢測(cè)血清雌二醇ESTRADIOL，E2濃度，免疫印跡法（WESTERNBLOT，WB）和實(shí)時(shí)熒光定量PCRREALTIMEQUANTITATIVEPOLYMERASECHAINREACTION，RTPCR分別檢測(cè)海馬區(qū)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶CHOLINEACETYLTRANSFERASE，CHAT，雌激素受體Α（ESTROGENRECEPTALPHA，ERΑ），神經(jīng)元型一氧化氮合酶NEURONALNITRICOXIDESYNTHASE，NNOS蛋白和基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果1與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng)，跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少P＜001，與模型組比較，電針組治療后逃避潛伏期縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)增加P＜0012與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清E2濃度顯著降低P＜001，與模型組比較，電針組和假電針組血清E2濃度顯著升高，電針組升高更明顯P＜0013與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CHAT、ERA、NNOS蛋白和MRNA表達(dá)均顯著降低P＜001，與模型組比較，電針組和假電針組CHAT、ERA、NNOS蛋白和MRNA表達(dá)均有升高，但電針組升高更明顯P＜001。結(jié)論1電針能夠提高低雌激素性認(rèn)知功能障礙大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。2其機(jī)制可能與升高體內(nèi)雌激素從而上調(diào)海馬CHAT、ERA、NNOS蛋白和MRNA的表達(dá)有關(guān)。

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